高考命題頻率較高:“限制酶”考點及分析
“限制酶”是高考試題中命題頻率較高的知識點,也是高考備考的核心知識點。下面結(jié)合典型試題,對相關(guān)知識進行歸納和整合,希望能對廣大考生的復(fù)習(xí)備考有所裨益。
一、酶切結(jié)果的推導(dǎo)
限制酶作為酶類,決定其催化作用具有高效性、專一性和作用條件溫和等特點。其中專一性的具體表現(xiàn)為:某種限制酶只能催化DNA上特定序列特定位點的磷酸二脂鍵水解,結(jié)果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。限制酶所識別的雙鏈DNA上的序列具有“回文對稱”性質(zhì),即無論是奇數(shù)個堿基還是偶數(shù)個堿基,都可以找到一條中心軸線,中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時,即錯位平切,產(chǎn)生的是黏性末端;當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時,即平切,產(chǎn)生平末端。錯位切的限制酶在基因工程中最常使用,因為與平末端相比較,黏性末端更有利于DNA片段的連接。
例1下面是5種限制性內(nèi)切酶對DNA分子的識別序列和剪切位點圖(↓表示剪切點、切出的斷面為黏性末端):限制酶1:——↓GATC——;限制酶2:——CATG↓——;限制酶3:——G↓GATCC——;限制酶4:——CCGC↓GG——;限制酶5:——↓CCAGG——。請指出下列哪組表達正確( )
A.限制酶2和4識別的序列都包含4個堿基對
B.限制酶3和5識別的序列都包含5個堿基對
C.限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D.限制酶1和2剪出的黏性末端相同
解析:限制酶2、3、4、5識別的序列分別包括4個、6個、6個、5個堿基對,故A、B錯。限制酶1和2切割產(chǎn)生的黏性末端不同。限制酶1剪出的黏性末端是:—C T A G,限制酶2剪出的黏性末端是:—C A T G,限制酶3切割產(chǎn)生的黏性末端是:—C T A G,故D錯。
答案 C
二、酶切方法的選擇
構(gòu)建重組質(zhì)粒,需要用限制酶分別切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒,切割方法主要有單酶切和雙酶切。單酶切是指用同一種限制酶對含目的基因的DNA和質(zhì)粒進行切割,目的基因序列的兩邊必須各有一個能被該限制酶識別的序列及切點,而質(zhì)粒至少有一個識別序列及切點,這樣被切割的質(zhì)粒與切下的目的基因兩邊形成相同的黏性末端,以實現(xiàn)連接而形成重組質(zhì)粒,有時也可以用兩種不同的限制酶(同尾酶)切割產(chǎn)生相同的黏性末端。雙酶切是指用兩種限制酶進行切割,含目的基因的DNA和質(zhì)粒上都必須有能被這兩種限制酶識別的序列及切點,結(jié)果兩者都會產(chǎn)生具有兩種不同的黏性末端的DNA片段,兩個末端分別用A與B表示,然后混合起來,那么載體分子的A端與目的基因的A端連接,載體分子的B端與目的基因的B端連接,形成重組DNA分子,這樣就可以避免DNA連接酶催化時被切割后的質(zhì)粒自連成環(huán)的現(xiàn)象,并能保證質(zhì)粒與目的基因的定向連接。
例2基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,便于重組和篩選。已知限制酶I的識別序列和切點是—G↓GATCC-,限制酶Ⅱ的識別序列和切點是-↓GATC-。根據(jù)圖示,判斷下列操作正確的是( )
A.質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割
B.質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割
C.目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割
D.目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割
解析:在切割質(zhì)粒時應(yīng)遵循一個原則:不能同時將兩個標(biāo)記基因切開,至少保留一個,所以只能用酶Ⅰ切割,而從目的基因兩側(cè)堿基序列可知,只能用酶Ⅱ才得到含目的基因的DNA片段。
答案:A
例3如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物,生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性核酸內(nèi)切酶,SmaⅠ的識別序列和切點是——C↓CCGGG—。下列說法錯誤的是( )
A.圖中質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后,分別含有0、2個游離的磷酸基團
B.要用PstⅠ和EcoRⅠ這兩種限制酶分別去切割含抗原基因的DNA、質(zhì)粒
C.對圖中質(zhì)粒進行改造,插入的SmaⅠ酶切位點越多,質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越低
D.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來
解析:因為該質(zhì)粒為環(huán)狀,所以在沒有經(jīng)過SmaⅠ切割前,其不含游離的磷酸基團,當(dāng)被SmaⅠ酶切割后該質(zhì)粒變成以一條DNA分子,含有兩條單鏈,而在每條單鏈的5′端會都含有一個游離的磷酸基團。構(gòu)建過程中需要將目的基因完整切割下來,此時要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ,質(zhì)粒的切割也要用這兩種限制酶,與只使用一種限制酶相比較,其優(yōu)點在于能防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,同時確保構(gòu)建的重組質(zhì)粒只有一種。因為對該該質(zhì)粒進行改造是只插入SmaⅠ酶切位點,相對于質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性而言,含有的C-G堿基對越多,則所含的氫鍵越多,其熱穩(wěn)定性越高??箍敲顾鼗蚴菢?biāo)記基因,目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細胞。
答案:C
三、酶切圖譜的構(gòu)建
酶切圖譜是指選取某一特定長度的DNA分子,用多種限制酶單獨或聯(lián)合切割,再通過電泳技術(shù)將酶切片段進行分離,計算相對大小,以確定每一種限制酶在DNA分子中的切點位置和相對距離,并據(jù)此繪制而成的物理圖譜(一般以直線或環(huán)狀圖式表示)。
例4用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ單獨或聯(lián)合切割同一種質(zhì)粒,得到的DNA片段長度如下圖(1kb即1000個堿基對),請在下圖中畫出質(zhì)粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位點。
解析:分析題中圖解可知,用EcoRⅤ切割質(zhì)粒只得到長度為14 kb的一個片段,說明該酶在質(zhì)粒上只有1個切點;同理可以推測MboⅠ在質(zhì)粒上有2個切點;由圖中可以看出同時用兩種限制酶切割時得到了3個片段,由此可以推測限制酶EcoRⅤ的切點在圖中11.5 kb的DNA片段中。具體切割位點見答案。
答案:見右圖:
變式訓(xùn)練
1.下列四條DNA分子,彼此間具有粘性末端的一組是( )
A.①② B.②③ C.③④ D.②④
答案:D
2.在DNA測序工作中,需要將某些限制酶的限制位點在DNA上定位,使其成為DNA分子中的物理參照點,這項工作稱為“限制酶圖譜的構(gòu)建”?,F(xiàn)用限制酶HindⅢ、BamHI以及二者的混合物分別降解一個4kb(1kb即1千個堿基對)大小的線性DNA分子,然后通過某種方法將獲得的不同長度的DNA片段分開,結(jié)果如下圖所示:
據(jù)此分析,這兩種限制酶在該DNA分子上的限制位點數(shù)目是以下哪一組( )
A.HindⅢl個,BamHI2個 B.HindⅢ2個,BamHI3個
C.HindⅢ2個,BamHI1個 D.HindⅢ和BamHI各有2個
答案:A
3.圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度(bp即堿基對)和部分堿基序列,圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列。現(xiàn)有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4種限制性核酸內(nèi)切酶,它們識別的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請回答下列問題
(1)圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個堿基之間依次由 連接。
(2)若用限制酶SmaI完全切割圖1中DNA片段,產(chǎn)生的末端是 末端,其產(chǎn)物長度為 。
(3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對被T-A堿基對替換,那么基因D就突變?yōu)榛騞。從雜合子中分離出圖1及其對應(yīng)的DNA片段,用限制酶Sma I完全切割,產(chǎn)物中共有 種不同長度的DNA片段。
(4)若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行連接,形成重組質(zhì)粒,那么應(yīng)選用的限制酶是 。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后,為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌,一般需要用添加 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。經(jīng)檢測,部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達,其最可能的原因是 。
答案:(1)脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖(2)平 537bp、790bp、661bp (3)4
(4)BamH I 抗生素B 同種限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因D與質(zhì)粒反向鏈接