高中生物選修三基因工程基本操作程序
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高中生物選修三基因工程基本操作程序：
第一步：獲取目的基因
第二步：構建基因表達載體
第三步：將表達載體導入受體細胞
第四步：目的基因的檢測與表達
(1)提取目的基因：獲取目的基因是實施基因工程的第一步.如植物的抗病(抗病毒 抗細菌)基因,種子的貯藏蛋白的基因,以及人的胰島素基因干擾素基因等,都是目的基因.
要從浩瀚的“基因海洋”中獲得特定的目的基因,是十分不易的.科學家們經過不懈地探索,想出了許多辦法,其中主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因;另一條是人工合成基因.
直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”,又叫“散彈射擊法”.鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段,將這些片段分別載入運載體,然后通過運載體分別轉入不同的受體細胞,讓供體細胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制(在遺傳學中叫做擴增),從中找出含有目的基因的細胞,再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來.如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得.
用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點是操作簡便,缺點是工作量大,具有一定的盲目性.又由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段,一般使用人工合成的方法.
目前人工合成基因的方法主要有兩條.一條途徑是以目的基因轉錄成的信使RNA為模版,反轉錄成互補的單鏈DNA,然后在酶的作用下合成雙鏈DNA,從而獲得所需要的基因.另一條途徑是根據已知的蛋白質的氨基酸序列,推測出相應的信使RNA序列,然后按照堿基互補配對的原則,推測出它的基因的核苷酸序列,再通過化學方法,以單核苷酸為原料合成目的基因.如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得.
(2)目的基因與運載體結合：基因表達載體的構建(即目的基因與運載體結合)是實施基因工程的第二步,也是基因工程的核心.
將目的基因與運載體結合的過程,實際上是不同來源的DNA重新組合的過程.如果以質粒作為運載體,首先要用一定的限制酶切割質粒,使質粒出現一個缺口,露出黏性末端.然后用同一種限制酶切斷目的基因,使其產生相同的黏性末端.將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處,再加入適量DNA連接酶,質粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會因堿基互補配對而結合,形成一個重組DNA分子.如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質粒DNA分子結合,形成重組DNA分子(也叫重組質粒)的.
(3)將目的基因導入受體細胞：將目的基因導入受體細胞是實施基因工程的第三步.目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重組DNA分子后,下一步是將重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增.
基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌,枯草桿菌,土壤農桿菌,酵母菌和動植物細胞等.
用人工方法使體外重組的DNA分子轉移到受體細胞,主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑.例如,如果運載體是質粒,受體細胞是細菌,一般是將細菌用氯化鈣處理,以增大細菌細胞壁的通透性,使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞.目的基因導入受體細胞后,就可以隨著受體細胞的繁殖而復制,由于細菌的繁殖速度非?？?在很短的時間內就能夠獲得大量的目的基因.
(4)目的基因的檢測和表達：目的基因導入受體細胞后,是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性,只有通過檢測與鑒定才能知道.這是基因工程的第四步工作.
以上步驟完成后,在全部的受體細胞中,真正能夠攝入重組DNA分子的受體細胞是很少的.因此,必須通過一定的手段對受體細胞中是否導入了目的基因進行檢測.檢測的方法有很多種,例如,大腸桿菌的某種質粒具有青霉素抗性基因,當這種質粒與外源DNA組合在一起形成重組質粒,并被轉入受體細胞后,就可以根據受體細胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因.重組DNA分子進入受體細胞后,受體細胞必須表現出特定的性狀,才能說明目的基因完成了表達過程.
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