高二生物選修1知識點總結(3)
《血紅蛋白的提取和分離》
基礎知識
1.凝膠色譜法
凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實際上是一些由 構成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時速度不同，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動速度 ;而相對分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動，路程 ，移動速度 。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。
2.緩沖溶液
緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進行的各種生物化學反應都是在一定的pH下進行的，例如：血漿的pH是 ，要在實驗條件下準確模擬生物體內(nèi)的過程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。
3.電泳
電泳是指 。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上 。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷 的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。
兩種常用的電泳方法是 和 ，在測定蛋白質(zhì)分子量時通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。
4.蛋白質(zhì)的提取和分離
蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、 、 和 。
5.樣品處理
血液由 和 組成，其中紅細胞最多。紅細胞具有
的特點。紅細胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì) ，其作用是
，血紅蛋白有 個肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈環(huán)繞一個 ，磁基團可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅色。
紅細胞的洗滌 洗滌紅細胞的目的是 ，采集的血樣要及時采用 分離紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ，將下層暗紅色的 倒入燒杯，再加入 ，緩慢攪拌 ，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至 ，表明紅細胞已洗滌干凈。
血紅蛋白的釋放 在 和 作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。
分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的 ，第2層為白色薄層固體，是 ，第3層是紅色透明液體，這是 ，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。
透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入 中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的 。
6.凝膠色譜操作
第一步要制作 ，第二步要 ，因為 ，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時，不得有 存在。因為氣泡會 ，降低分離效果。第三步是 。
[疑難點撥]
1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理
凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時，各分子在色譜柱內(nèi)進行兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快;相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結構，相對分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀結構上的空襲時阻力大，而相對分子質(zhì)量小的分子通過時阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。
2.與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質(zhì)的分離的意義
哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀，沒有細胞核和細胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。
3.電泳的作用及其原理
電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電;在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。
4.你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎?
答：凝膠實際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快;相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。
[典例解析]
用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，分子量大的蛋白質(zhì)( D )
A路程較長，移動速度較慢 B路程較長，移動速度較快
C路程較短，移動速度較慢 D路程較短，移動速度較快
解析：在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢;而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。
經(jīng)典例題剖析
例題1、關于果酒制作過程中的敘述正確的是( B )
A先去爛子粒和枝梗，再用清水沖洗污物 B發(fā)酵的溫度維持在20℃最好
C發(fā)酵過程中需要適時打開瓶蓋放氣，以防發(fā)酵瓶破裂 D需要不斷的充入氧氣
解析：為防雜菌污染，爛子粒應該沖洗之前去除，而去枝梗應在沖洗之后;酵母菌酒精發(fā)酵需在無氧條件下進行，通氣時只能擰松瓶蓋不可打開瓶蓋;最適宜溫度為20℃。
例題2、關于果醋制作過程中的敘述正確的是( C )
A打開發(fā)酵瓶是因為全過程需要通入氧氣，排出二氧化碳
B醋酸菌在糖源和氧氣充足時，能將葡萄糖分解成醋酸和二氧化碳
C當糖源不足時，醋酸菌可將酒精分解成醋酸
D要使果酒變成果醋只需通入氧氣，加入醋酸菌就可以了
解析：醋酸菌和酵母菌發(fā)酵的區(qū)別在于前者需氧，不產(chǎn)生二氧化碳，而且發(fā)酵的最適溫度也不同。
例題3、腐乳制作過程中影響其風味和品質(zhì)的因素有哪些?( A )
?、冫}的用量 ② 酒的種類和用量 ③發(fā)酵溫度 ④ 發(fā)酵時間 ⑤辛香料的用量
A①②③④⑤ B ①②③ C ①②⑤ D ③④
解析：鹽、酒、辛香料不僅用來調(diào)味，還可抑菌，防腐乳變質(zhì)。適宜的鹽的用量和酒的濃度還影響發(fā)酵中蛋白酶的作用發(fā)揮;發(fā)酵時間和溫度都會影響腐乳的風味。
例題4、將10毫升酵母菌液放在適宜的溫度下培養(yǎng)，并且于不同時間內(nèi)等量均勻取樣4次，分別測定樣品中酵母菌的數(shù)量和PH，結果如下表。請分析回答：
樣品 酵母菌的數(shù)量(個/mm3) PH 1 1210 4.8 2 820 5.4 3 1210 3.7 4 1000 5.0 ① 表中樣品取樣先后次序是
?、趯湍妇裕?0毫升該培養(yǎng)液的環(huán)境負荷量為 個。
?、廴舻谖宕尉鶆蛉訒r，樣品中的酵母菌數(shù)量為760(個/mm3)，產(chǎn)生這一結果的原因是 。
解析:(1)由于酵母菌進行有氧呼吸和無氧呼吸都產(chǎn)生二氧化碳，使發(fā)酵液的酸性增強。根據(jù)樣品PH大小，越早取樣PH越大，由此取樣順序為2、4、1、3。
(2)經(jīng)過培養(yǎng)10mL培養(yǎng)液中有菌數(shù)1210個/mm3，環(huán)境負荷量應為1.21×107。
(3)培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，pH值減小，部分酵母菌因營養(yǎng)缺乏不適應而死亡并解體。
答案： 2、4、1、3;1.21×107;培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，pH值減小，部分酵母菌因營養(yǎng)缺乏不適應而死亡并解體。
例題5、水果罐頭蓋上印有"如發(fā)現(xiàn)蓋子鼓起，請勿選購"的字樣，引起蓋子鼓起的最可能原因是( B )
A、好氧型細菌呼吸，產(chǎn)生CO2和H2O B、酵母菌呼吸，產(chǎn)生CO2和C2H5OH
C、乳酸菌呼吸，產(chǎn)生 CO2和 C3H6O3 D、酵母菌呼吸，產(chǎn)生CO2和 H2O
[解析] 罐頭是密封、殺菌的，但不排除有微生物的孢子等存活下來，只有進行無氧呼吸的微生物可以生存;罐頭鼓脹是過期后微生物生活產(chǎn)氣的結果，乳酸菌無氧呼吸產(chǎn)生乳酸，無氣體產(chǎn)生;酵母菌既可以在有氧條件下生活，也可以在無氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生酒精和二氧化碳。
例題6、有人測定了A、B、C、D四種植物體內(nèi)多種酶的活性與溫度的關系，結果如下圖所示。根據(jù)圖中的信息，你認為在25攝氏度條件下，競爭能力最強的生物和對溫度適應范圍最廣的生物分別是( A )
A B和D B B和C C B和A D A和C
催 C D
化 100 A B
效
率 50
( %)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
[解析] 酶活性具有一定的溫度范圍和適宜溫度，溫度過高酶會失活，低溫對酶活性抑制;在一定溫度下，最適宜該溫度的酶活性最強，該生物生活的也最好，競爭力就強;酶有活性的范圍最大，生物的生存溫度范圍就越廣。
例題7、(05年杭州高三第一次檢測)下圖是人體內(nèi)某個化學反應的示意圖，圖中代表酶的英文字母是( A )
[解析] 酶是起催化作用的，它在反應前后的性質(zhì)保持不變，據(jù)圖可以解釋A 所代表的物質(zhì)是酶。所以在特定條件和一定的時間內(nèi)，酶的催化作用可以一直保持。
例題8、(04年北京東城區(qū)綜合檢測) 實驗研究pH對酶活性的影響，準備5支含有等量胃蛋白酶溶液但pH各不相同的試管，每支試管加1塊1 cm3的正方體凝固蛋白塊，試管均置于25 ℃室溫條件下，將各試管蛋白塊消失的時間記錄于下表：
酶溶液的pH 蛋白塊消失的時間(min) 1
2
3
4
5 13
9
11
45
>60 (1)酶活性最強時的pH是_________。
(2)蛋白塊消失的時間與酶活性強弱的關系是_________。
(3)請以2種方法改進實驗，使實驗在更短的時間內(nèi)完成。
(4)在人體消化道中，能分泌本實驗中酶的部位是_________。
(5)為確認蛋白塊的消失是由于酶的作用，還應對實驗進行什么設計
[答案] (1)2
(2)酶活性越大，蛋白質(zhì)分解越快，蛋白塊消失的時間越短
(3)方法Ⅰ：將題給溫度由25℃提高至大約37℃。方法Ⅱ：將原題中正方體蛋白塊處理得更小(如切成0.5×0.5×0.5=0.125 cm3)，這相當于消化道內(nèi)進行的物理性消化
(4)胃(答小腸不給分，因pH與題意不符)
(5)另增加一個試管，放入等量的蛋白塊并將pH調(diào)得適當，但不加酶溶液
例題9、現(xiàn)有相同容積的玻璃缸幾只，利用自然的清水、同齡且發(fā)育狀態(tài)相同的小蝌蚪60只、飼喂蝌蚪的飼料、未經(jīng)處理的具有生物活性的甲狀腺激素，并把具有生物活性的甲狀腺激素放在50℃的溫水中處理10 min。根據(jù)這些現(xiàn)有的條件，請你設計一個實驗，驗證甲狀腺激素經(jīng)過處理以后，是否還有生物活性。?
(1) 實驗方案的設計
第一步，取玻璃缸3只，分別標記為甲、乙、丙;
第二步， ;
第三步，如果甲缸每天飼喂飼料，丙缸每天飼喂用具有生物活性的甲狀腺激素相拌的飼料，則乙缸怎樣飼喂? ;
最后經(jīng)過一定時間的飼喂，觀察現(xiàn)象，得出結果和結論。?
(2) 結果分析
?、偃粢?、丙缸的蝌蚪發(fā)育同步，迅速變態(tài)為小青蛙，而甲缸還是蝌蚪狀態(tài)，說明
;
?、谌艏?、乙缸的蝌蚪發(fā)育同步，而丙缸發(fā)育變態(tài)迅速，說明了 ?
。
?、廴粢腋椎尿蝌桨l(fā)育比甲缸快，比丙缸慢，則說明了
。?
(3)該實驗設置甲、丙兩組實驗的目的是 。?
[答案](1)分別加入等量的清水和20只蝌蚪 每天飼喂用經(jīng)過處理過的甲狀腺激素
相拌的飼料
(2)①甲狀腺激素經(jīng)過50℃的溫水處理后，對其生物活性沒有影響 ②甲狀腺激素經(jīng)過50℃的溫水處理后，完全喪失了生物活性 ③甲狀腺激素經(jīng)過50℃的溫水處理后，使生物活性有所降低
(3)起對照作用
例10、 在DNA分子的粗提取實驗中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是( )
A. 稀釋血液、沖洗樣品
B. 使血細胞破裂，降低NaCl濃度使DNA析出
C. 使血細胞破裂，增大DNA溶解度
D. 使血細胞破裂，提取含雜質(zhì)較少的DNA
解析：在該實驗過程中，第一次加入蒸餾水的目的是使血細胞過度吸水而破裂，以便核物質(zhì)溶解。第二次加入蒸餾水是為了降低NaCl濃度至0.14mol/l，因為此時的DNA溶解度最小，可使DNA析出。
例11、 在制備雞血細胞液的過程中，加入檸檬酸鈉的目的是( A )
A. 防止凝血 B. 加快DNA析出 C. 加快DNA溶解 D. 加速凝血
解析：檸檬酸鈉的作用是利用檸檬酸根離子與血漿中Ca2+離子結合成檸檬酸鈉，降低Ca2+離子濃度，使有關凝血酶活性降低。因此檸檬酸鈉是抗凝血物質(zhì)，防止凝血，有利于雞血細胞液的制備。
例12、去除DNA雜質(zhì)時，可直接在濾液中加入( A )，反應10-15min
A. 嫩肉粉 B. 蒸餾水 C. 2mol/lNaCl D. 酒精
解析：嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)
例13、 DNA在NaCl溶液中溶解度有二重性，隨著NaCl溶液的變化而變化。
(1)請在下列NaCl溶液中選出溶解度能使DNA析出最徹底的一種( )和溶解度最高的一種( )
A. 0.14mol/l B. 2mol/l C. 0.15mol/l D. 0.3mol/l
(2)DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些物質(zhì)卻可以溶于酒精溶液，利用這一原理可以____________，可以推測溶于酒精中的物質(zhì)可能有____________。
(3)利用DNA與_____變藍色的特性，將該物質(zhì)作為鑒定______的試劑。其實驗過程要點是向放有_____的試管中加熱4ml的____?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜赺__5min，待試管______，觀察試管中溶液顏色的變化，這個實驗也說明DNA耐___溫。
解析：根據(jù)實驗原理可知DNA在0.14mol/l的NaCl溶液中溶解度最低，在高濃度2mol/l中，溶解度最高。DNA存在于染色體上，為了把DNA和其他物質(zhì)分開，采取DNA不溶于酒精的方法，目的是除去雜質(zhì);利用DNA與二苯胺(沸水浴)成藍色的特性，可以鑒定提取的DNA。
答案：(1)A;B
(2)除去雜質(zhì);某些脂類、蛋白質(zhì)、糖類或其他大分子物質(zhì)
(3)二苯胺;DNA;DNA;二苯胺試劑;沸水中水浴加熱;冷卻后;高
例14、關于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面敘述中正確的時( D )
A. 隨著NaCl溶液濃度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大
B. 隨著NaCl溶液濃度的減少，DNA在NaCl溶液中的溶解度也減少
C. DNA在NaCl溶液中的溶解度與NaCl溶液的濃度無關
D. 當NaCl溶液的濃度為0.14mol/l時，DNA的溶解度最低
例15、在"DNA的粗提取與鑒定"的實驗中，將提取獲得的含有DNA的粘稠物(還含有較多雜質(zhì))分別處理如下：
第一， 放入0.14mol/l的NaCl溶液，攪拌后過濾，得濾液A和粘稠物a
第二， 放入2mol/l的NaCl溶液，攪拌后過濾，得濾液B和粘稠物b
第三， 放入冷卻的95%的酒精溶液中，攪拌后過濾，得濾液C和粘稠物c
以上過程獲得的濾液和粘稠物中因含DNA少而可以放棄的是 A、b、C 。
解析：在不同濃度的NaCl溶液中DNA的溶解度是不同的。在0.14mol/l的NaCl溶液中DNA的溶解度最小，呈絲狀物析出。在2mol/l的NaCl溶液中DNA的溶解度最大，所以DNA呈溶解狀態(tài)，過濾后存在于濾液中。酒精溶液可使DNA分子凝集，呈絲狀物，過濾后存在于粘稠物中。
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