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辣椒素對非小細胞肺癌侵襲能力影響及其機制討論
近年來，關于辣椒素( capsaicin，CAP) 抗癌作用的研究在國內(nèi)外日益受到學者的高度重視。辣椒素是紅辣椒中的一種活性成分。最近有研究表明，辣椒素可以抑制癌癥細胞的增殖，促進凋亡，因此可以作為一種藥物或傳統(tǒng)化療藥物的輔助用藥。目前惡性腫瘤占全球死因的第1 位，而肺癌是癌癥相關死亡的首要原因，5年生存率15%。據(jù)預測，到2020 年，中國將有550 萬新發(fā)肺癌病例，死亡人數(shù)將達400 萬。在肺癌的病理學分型中，80% 為非小細胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) ，包括腺癌、鱗狀上皮細胞癌和大細胞癌，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力是導致患者死亡及復發(fā)的主要原因，并使其成為作為當今世界上對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一，給患者和家屬及其社會帶來極大的經(jīng)濟負擔。雖然辣椒素具有抗癌癥作用，但是其有關于NSCLC 的研究鮮見報導。本研究采用人大細胞肺癌NCI-H460 細胞，旨在觀察辣椒素對NCIH460細胞侵襲能力及E 鈣黏蛋白( E-cadherin) ，Slug 蛋白表達的影響，為明確辣椒素治療惡性腫瘤提供實驗依據(jù)，探討其可能作用機制，以期為NSCLC 治療提供新思路。
1 材料
1. 1 細胞人大細胞肺癌細胞NCI-H460，購自中科院上海細胞庫。
1. 2 藥物及試劑辣椒素( 純度 99%) ，MTT，羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽( 美國Sigma 公司，批號分別為100081-201408，M2128，PHDR1) ，Transwell 小室( 美國Corning 公司，批號3140908 ) ，E-cadherin 蛋白，Slug 蛋白，-actin( 上海浩然生物技術有限公司，批號分別為著名ZM0092，ZM2356，1208) ，E-cadherin鼠抗人單克隆抗體( 美國Pro Mab 公司，批號70796267A2) ，Slug 兔抗人多克隆抗體( 美國SantaCruz 公司，批號B2206) ，HRP 標記抗鼠IgG 二抗及HRP 標記抗兔IgG 二抗( 上海碧云天公司，批號BSE-0140G，BSE-0520G) ，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( 日本Promega 公司，批號9035-81-8) ，Quant SYBR GreenPCR 試劑盒( 美國TaKaRa 公司，批號BS-PCR003) 。
1. 3 儀器DFC 450C 型倒置顯微鏡( 德國萊卡公司) ，ABI-7300 型PCR 儀( 美國ABI 公司) 。
2 方法
2. 1 細胞培養(yǎng)NCI-H460 細胞保存在含有10%BSA 的RPMI-1640 營養(yǎng)培養(yǎng)基( 含L-谷氨酰胺，青霉素100 UmL - 1 和鏈霉素100 UmL - 1 ) ，37 ℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當NCI-H460 細胞達80%匯合度時，用0. 05%胰蛋白酶/0. 02% EDTA 消化。按照細胞密度2 106 個/孔接種于超低吸附6孔板中， 37 ℃，5 %CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48 h。收集懸浮的細胞經(jīng)EDTA 處理制備成單細胞懸液，然后用RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌細胞。收集對數(shù)生長期細胞，備用。
2. 2 藥物配置辣椒素溶解于DMSO，配成500 mmolL - 1溶液，- 20 ℃ 保存。臨用時，以完全培養(yǎng)液將辣椒素稀釋到所需濃度。
2. 3 MTT 比色分析法測定細胞抑制率取對數(shù)生長期NCI-H460 細胞，按照細胞密度1 104 個/孔接種于96 孔板中，總體積為200 L，過夜培養(yǎng)。次日，實驗組每孔加入終濃度為0， 100， 200， 300，400，500 molL - 1的辣椒素，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。每組設6 個平行孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃ 5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24， 48 h 后，每孔加入MTT 溶液( 5 gL - 1 ) 20L， 37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，然后每孔加入DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，570 nm 波長處，以空白培養(yǎng)液調(diào)零點，酶標儀測定吸光度A，取6 孔平均值。在graphpad prism 5 統(tǒng)計軟件中計算出半數(shù)抑制濃度( IC50) 。抑制率= ( A實驗組- A空白組) /( A空白組- A對照組) 100%。
2. 4 微絲熒光染色觀察根據(jù)江隆昌和歐陽理權等方法，取對數(shù)生長期NCI-H460 細胞，按照細胞密度2 103 個細胞/接種于96 孔板中，實驗組每孔加入終濃度為100， 200， 300 molL - 1 的辣椒素各10L，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。每組設6 個平行孔。PBS 洗滌2 次，再用4%多聚甲醛溶液于37 ℃固定10 min; 然后，用含0. 1%TritonX-100 的PBS 洗滌細胞3 次，每次4 min。用含0. 2%BSA 的PBS 封閉30 min。隨后，將細胞與1∶ 100羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽PBS 孵育15 min，PBS 洗滌3次。Olympus IX51 型熒光顯微鏡496 nm 處，觀察細胞微絲的形態(tài)學變化。實驗重復3 次。
2. 5 Transwell 小室體外侵襲實驗根據(jù)史立宏等方法，Transwell 小室用前鋪上0. 5% Matrigel膜基質(zhì)50 L 于37 ℃孵育過夜4 h。取對數(shù)生長期NCI-H460 細胞，將實驗組細胞用終濃度為100，200，300 molL - 1 的辣椒素， 37 ℃ 5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。按照5 104 個細胞接種于Transwell 小室內(nèi)室，并在Transwell 小室下室加入含有10% BSA 的完全培養(yǎng)液。孵育24 h 后，取出Transwell 小室去除未穿膜細胞。甲醇固定15 min 后，再以10 gL - 1 Hoechst33342 染色30 min。OlympusIX51 熒光顯微鏡計數(shù)穿過微孔膜的細胞數(shù)。每組細胞隨機計數(shù)10 個視野，取其平均值。實驗重復3 次。
2. 6 Western blot 分析取對數(shù)生長期NCI-H460 細胞，將實驗組細胞用終濃度為100， 200， 300 molL - 1的辣椒素， 37 ℃ 5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。用細胞裂解液( 20 mmolL - 1 Tris-HCl， 1. 5%Triton X-100，150 mmolL - 1 NaCl，10% 甘油，1 mmolL - 1Na4P2O7，50 mmolL - 1 NaF，1 mmolL - 1 PMSF) 和蛋白酶抑制劑( 5 molL - 1 AEBSF-HCl，5 molL - 1EDTA，10 mmolL - 1 leupeptin，1. 5 mmolL - 1 E-64，pH 7. 4) 裂解細胞后，收集裂解液，Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量。取20 g 蛋白質(zhì)加入等體積2 上樣緩沖液，95 ℃ 變性5 min。隨后進行7. 5% SDSPAGE凝膠電泳。電泳后，電轉(zhuǎn)至0. 45 m 硝酸纖維素膜，用含5% 的脫脂奶粉PBST( 25 mmolL - 1Tris pH 7. 5， 150 mmolL - 1 NaCl，0. 1% Tween20) 封閉1 h，分別加入E-cadherin 抗體，Slug 抗體( 1∶ 1 000稀釋) 4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3 次，每次5 min。加入HRP 標記的二抗( 1∶ 2 000 稀釋) 室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min。按同樣的方法與-actin 抗體孵育。ECL 化學發(fā)光試劑顯色，通過Bio-Rad 凝膠成像進行目的條帶的表達檢測及分析。蛋白的相對表達強度= 目標蛋白表達強度/-actin蛋白表達強度。
2. 7 Real-Time PCR( RT-PCR) 分析取對數(shù)生長期NCI-H460 細胞，將實驗組細胞用終濃度為100，200， 300 molL - 1 的辣椒素， 37 ℃ 5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。按照TRIzol 試劑盒說明書抽提總RNA。Nanodrop2000 檢測RNA 純度。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應，成單鏈的cDNA，操作按照試劑盒說明書進行。利用Pubmed查找相關基因序列，并利用引物合成軟件PrimerPremier 5. 0 設計引物，引物序列見表1。使用QuantSYBR Green PCR 試劑盒按照PCR 引物進行擴增，用Applied Biosystems 7500 型定量PCR 儀測出Ct值及熔解曲線，計算出相對基因表達量。每份樣品檢測3 次。
2. 8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17. 0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用珋x s 表示，正態(tài)資料組間比較采用t 檢驗，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析，以P 0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。
3 結(jié)果
3. 1 對NCI-H460 細胞增殖的影響不同終濃度( 100 ～ 500 molL - 1 ) 的辣椒素分別作用于NCIH460細胞24，48 h 后，隨著終濃度的增大和作用時間的延長，其對細胞的抑制率也明顯增強，呈濃度和時間依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義( P 0. 05) 。辣椒素24， 48 h 的IC50分別為366. 2，328. 2 molL - 1。
3. 2 對NCI-H460 細胞絲狀偽足形成的影響微絲熒光染色后發(fā)現(xiàn)，辣椒素終濃度為100 molL - 1時，NCI-H460 細胞有明顯的絲狀偽足形成，表現(xiàn)為細胞表面形成微絲突起并且延伸到細胞外，而且充滿與相鄰的其他腫瘤細胞相接觸的平行排列肌絲纖維。辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時，NCI-H460 細胞未見明顯絲狀偽足形成，可有效抑制絲狀偽足的伸出，僅見細胞表面可見少量突起，肌動蛋白絲網(wǎng)狀排列。
3. 3 對NCI-H460 細胞體外侵襲能力的影響辣椒素終濃度為200，300 molL - 1時，NCI-H460 細胞侵襲細胞數(shù)均顯著下降，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義( P 0. 05) 。辣椒素終濃度為100 molL - 1時，NCI-H460 細胞侵襲細胞數(shù)雖然減少，但是與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義。
3. 4 對NCI-H460 細胞E-cadherin，Slug 蛋白表達的影響辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時，顯著升高E-cadherin 表達水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義( P 0. 05) 。辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時，顯著降低Slug 表達水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義( P 0. 05，P 0. 01) 。辣椒素終濃度為100 molL - 1 時，E-cadherin 和Slug 表達水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義。
3. 5 對NCI-H460 細胞E-cadherin，Slug mRNA 表達的影響辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時，顯著升高E-cadherin mRNA 表達水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義( P 0. 05) 。辣椒素終濃度為200，300 molL - 1 時，顯著降低Slug mRNA 表達水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義( P 0. 05，P 0. 01 ) 。辣椒素終濃度為100 molL - 1 時，Ecadherin和Slug mRNA 表達水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義。
4 討論
肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其中80%為NSCLC，只有20% ～ 30% 的患者有手術機會，但是即使是在手術切除的早期NSCLC 患者中，也有2 /3 的患者存在復發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險，侵襲轉(zhuǎn)移是患者死亡和治療效果不理想的主要原因。目前對于放療、化療等主要治療肺癌的手段已經(jīng)進入平臺期，然而其分子機制尚不明了，因此探討肺癌分子水平侵襲轉(zhuǎn)移機制尤為必要。
近年來，傳統(tǒng)中藥應用于抗癌癥的治療成為研究抗癌藥物的新的熱點，受到廣大醫(yī)藥學工作者的廣泛重視。辣椒素( 結(jié)構為反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯胺) 是紅辣椒中的一種活性成分，作為食物和傳統(tǒng)藥物已有幾千年的歷史，于1999 年載入《美國藥典》。辣椒素可通過多種途徑在體內(nèi)外發(fā)揮抗癌癥作用，如劉南等研究表明，辣椒素可抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤得生長。另外還有報道稱，辣椒素可誘導人黑色素瘤A375-S2 細胞的凋亡。然而辣椒素對NSCLC 是否具有抑制作用目前尚不明了。故此，本研究以不同終濃度辣椒素作用于NCI-H460 細胞，觀察辣椒素的抗NSCLC 效應。結(jié)果發(fā)現(xiàn)辣椒素對NCI-H460 細胞細胞活率有一定抑制作用，提示辣椒素具有潛在的抗NSCLC 效應。E-cadherin 是一類主要介導細胞之間相互黏附的鈣依賴性跨膜蛋白，主要表達在上皮細胞，廣泛參與細胞間的連接，對于維持正常上皮細胞的完整性十分重要。E-cadherin 結(jié)構和功能異?？芍掳┘毎g黏附松散，癌細胞極易從原發(fā)部位脫落，并沿淋巴管，血管外膜及組織間隙浸潤蔓延，破壞鄰近正常組織并繼續(xù)生長，形成轉(zhuǎn)移癌。Slug 基因是Snail超家族成員之一，能識別E-cadherin 基因啟動子上E2-box 元件以抑制靶基因E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)E-cadherin 蛋白表達，共同促進癌癥細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。趙志娟等研究表明，Slug 基因的過表達同時伴有E-cadherin 的低表達或缺失與誘發(fā)胰腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移高度相關。本研究中，以辣椒素處理NCI-H460 細胞，微絲熒光染色和Transwell 小室體外侵襲實驗結(jié)果顯示，辣椒素可顯著抑制絲狀偽足形成和侵襲細胞數(shù)，證明辣椒素可抑制癌癥細胞的侵襲。進一步通過Western blot 和RT-PCR 分析結(jié)果顯示，辣椒素可減少NCI-H460 細胞Slug 蛋白和mRNA 表達，增加E-cadherin 蛋白和mRNA 的表達，揭示辣椒素可能通過抑制Slug 表達而增加Ecadherin表達來抑制癌癥的遠處侵襲能力。本研究結(jié)果與趙志娟等研究結(jié)果高度類似，故此可以推測，抑制Slug 表達和增加E-cadherin 表達可抑制NSCLC 侵襲。
綜上所述，辣椒素具有明顯的NCI-H460 細胞毒性作用，可降低NCI-H460 細胞活率。而且辣椒素可通過降低Slug 表達，增加E-cadherin 表達抑制NCI-H460 細胞侵襲能力，可能是其抗NSCLC 的機制之一，為NSCLC 治療提供新的思路。
雷公藤甲素抗卵巢癌的研究進度
卵巢癌是較為常見的婦科惡性腫瘤，嚴重影響了女性健康。有研究表明，由于病灶位于盆腔深處，早期病變難以被發(fā)現(xiàn)，約有70%的患者在確診時已處于癌癥中晚期。臨床上多以手術治療為主、放化療為輔的綜合治療方案，但似乎療效甚微，大部分晚期卵巢癌患者出現(xiàn)復發(fā)及耐藥現(xiàn)象，5 年的生存率僅30%[1]。因此，迫切需要尋找能逆轉(zhuǎn)耐藥及新的抗卵巢癌藥物。雷公藤甲素(triptolide，TP)是中藥雷公藤的主要活性成分，具有廣譜、高效的抗腫瘤活性。TP 對多種腫瘤均有抑制作用，如黑素瘤、直腸癌、肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等。近年來，TP 對婦科腫瘤的作用引起了國內(nèi)外學者的關注，體內(nèi)外研究表明TP 可顯著抑制卵巢癌細胞的生長，并可抑制耐順鉑細胞株的生長，將其與傳統(tǒng)藥物合用治療卵巢癌，可增強癌細胞對藥物的敏感性，其機制主要與干預細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有關。
1 TP 對卵巢癌細胞的抑制作用
1.1 單獨對卵巢癌細胞作用
體外研究發(fā)現(xiàn)，TP 可顯著抑制卵巢癌細胞株A2780、SKOV-3 的增殖，且隨著濃度的增大、時間的延長，其抑制率升高，呈量-效、時-效關系，其48 h 半數(shù)抑制率IC50 約為34 nmol/L，而其對正常的人卵巢上皮細胞HIO-180 只有很小的影響，提示TP 對正常細胞和卵巢癌細胞的生長和增殖的抑制作用存在不同的機制。相比傳統(tǒng)化療藥物順鉑、絲裂霉素和紫杉醇，TP 具有更強的抗腫瘤活性。此外，TP 對耐順鉑卵巢癌細胞株OVCAR-3也有顯著的抑制作用，通過干預細胞周期，促進腫瘤細胞凋亡。體內(nèi)實驗表明，TP 對荷卵巢癌大鼠具有一定的抑制作用，且隨著濃度的升高，抑制腫瘤的作用越強。TP 可通過抑制大鼠體內(nèi)動脈環(huán)新生微脈管的形成而抑制卵巢腫瘤的生長[8]。用TP 處理卵巢癌細胞移植鼠，可明顯發(fā)現(xiàn)當給藥劑量為1 mg/kg 時，小鼠腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目減少了約80%。
1.2 與其他藥物聯(lián)合作用
當前，臨床上針對卵巢癌的治療多采用鉑類聯(lián)合紫杉醇的化療方案，但由于卵巢癌細胞對藥物產(chǎn)生的耐受性，其療效并不樂觀。多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1)是一種消耗ATP 轉(zhuǎn)運疏水性藥物移出細胞液的跨膜蛋白，是腫瘤細胞對紫杉醇、阿霉素等傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。研究顯示，TP 可降低MDR1 蛋白的表達，將其與化療藥物合用，可協(xié)同發(fā)揮療效。TP 與紫杉醇聯(lián)合使用可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞的耐藥，增強藥效，TP 與紫杉醇聯(lián)合作用于耐順鉑上皮卵巢癌細胞COC1/DDP，通過抑制PI3K/Akt/GSK3 信號通路顯著抑制癌細胞的增殖，促進其凋亡[11]。在較低濃度下，TP 與順鉑聯(lián)合使用對卵巢癌的抑制作用強于單獨使用順鉑，其抑制率隨時間延長明顯增高。姜黃素是從姜黃中提取出來的一種黃色素，具有抗腫瘤、抗炎等功效，TP 聯(lián)合使用低濃度的姜黃素，可顯著降低卵巢癌細胞中熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)27 和70 的表達，促進卵巢癌細胞凋亡[13-14]。雷公藤紅素也是雷公藤中活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤作用，TP 與雷公藤紅素協(xié)同作用比單獨使用TP 或雷公藤紅素對卵巢癌細胞的抑制作用強，使腫瘤細胞停滯于G2/M 期，并通過增加活性氧(ROS)的表達促進細胞凋亡。
2 TP 抗卵巢癌的作用機制
2.1 干預腫瘤細胞周期
一個細胞周期的順利進行受到嚴格的調(diào)控，而當細胞周期出現(xiàn)了失控就會導致腫瘤的產(chǎn)生和增殖。周期蛋白依賴性激酶( cyclin-dependentkinases，CDK)和周期蛋白(cyclin)協(xié)同作用，調(diào)控細胞周期。P21 是CDKs 的一種抑制劑，促進P21 的表達可抑制cyclin-CDK 復合物的形成。Wu 等研究發(fā)現(xiàn)TP 通過激活P53，與DNA 結(jié)合后可促進P21 的表達，進而抑制細胞周期蛋白復合物G1-S/CDK2 和G2-M/Cdc2 的形成，阻滯卵巢癌細胞的G1/S 期和G2/M 期。
2.2 抑制HSP 的表達
HSP 是高度保守蛋白，在保護細胞對抗不利的環(huán)境因素中起重要作用。HSP 的高表達被認為是許多癌癥發(fā)生的信號，HSP27、HSP70 和HSP90 的表達與癌癥密切相關。有研究表明HSP70 被認為是卵巢腫瘤侵襲的標志物，當其在腹腔和胸腔積液中表達水平上升時，意味著患者有較低的生存率。此外，HSP27 在藥物的耐受中發(fā)揮重要作用，并在藥物耐受的卵巢癌細胞中大量表達，研究認為HSP27是治療化療耐受腫瘤的潛在作用位點。TP 可下調(diào)HSP27 和HSP70 的表達，其機制為抑制熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF1 的活性，減少分子伴侶的表達，使敏感細胞應激性死亡，從而有利于卵巢癌的治療。
2.3 抑制核轉(zhuǎn)錄因子-B(NF-B)的激活
NF-B 是涉及炎癥反應的細胞核因子，參與調(diào)控細胞生長、增殖過程中的轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。NF-B 是核蛋白P50 和P65 的異質(zhì)二聚體，調(diào)控著許多基因的轉(zhuǎn)錄。NF-B可通過激活抗凋亡蛋白Bcl-2 和XIAP 抑制細胞的凋亡，從而導致腫瘤細胞對藥物的耐受，因此NF-B被認為是許多卵巢癌耐化療藥物的主要原因。Zhong 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TP 通過抑制線粒體復合物I，促進ROS 的表達而抑制NF-B 的激活，進而下調(diào)Bcl-2 和XIAP 的表達，并激活Caspase-3 通路，促進耐順鉑卵巢癌細胞的凋亡。此外，TP 可抑制人表皮生長因子受體(human epidermal growth factorreceptor，HER)2 的轉(zhuǎn)錄，其結(jié)合部位位于HER 2啟動子上游207 和103 bp 處，而該部位含有NF-B的結(jié)合位點，TP 通過抑制NF-B 活性，下調(diào)HER 2的磷酸化，進而抑制其下游的PI3K/Akt 信號通路，促進卵巢癌細胞的凋亡。
2.4 抑制缺氧誘導因子-1(HIF-1)的轉(zhuǎn)錄
HIF-1 是一種調(diào)控組織細胞對缺氧適應性反應的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)的基因涉及血管發(fā)生、細胞能量代謝以及細胞信號轉(zhuǎn)導等，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管再生及耐藥密切相關。由于HIF-1 在腫瘤血管生成中的重要作用，其可作為卵巢癌治療的一個潛在靶點。Zhou 等[8]研究發(fā)現(xiàn)TP 可有效抑制卵巢癌細胞SKOV-3 的增殖，其機制為TP 顯著性抑制SKOV-3 細胞中HIF-1 mRNA 的轉(zhuǎn)錄活性，劑量依賴性抑制其下游基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、Bcl-2、碳酸酐酶IX 的表達;并且通過特異性HIF-1 siRNA 干擾技術，可有效逆轉(zhuǎn)TP 對卵巢癌細胞的生長抑制及促進細胞凋亡作用，表明HIF-1 蛋白上調(diào)參與了TP 對SKOV-3 細胞的細胞毒作用。
2.5 抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達
腫瘤細胞的擴散是造成癌癥患者死亡的主要原因。卵巢癌細胞的擴散源自于直接轉(zhuǎn)移以及侵襲相鄰組織，且其擴散與一系列復雜的蛋白水解有關，包括降低細胞外基質(zhì)蛋白的表達和基底膜的形成?；|(zhì)金屬蛋白激酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種在癌細胞生長進程中發(fā)揮重要作用的蛋白水解酶，其通過下調(diào)基底膜的組分，增強細胞的運動性以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，并以此促進癌細胞進入血管內(nèi)滲和擴散。Zhao 等研究發(fā)現(xiàn)TP 可在mRNA 和蛋白質(zhì)水平顯著抑制卵巢癌細胞中MMP7 和MMP19 的表達，其抑制作用與TP 呈濃度依賴性。
此外，癌細胞擴散和轉(zhuǎn)移的一個重要步驟是需要從周圍的細胞中脫離出來。細胞通過細胞與細胞之間的黏附因子結(jié)合在一起，而E-鈣黏蛋白在哺乳動物細胞的黏連中起著重要作用。抑制E-鈣黏蛋白的表達，可以促進癌細胞的分離和轉(zhuǎn)移[29]。研究表明，TP 可在體內(nèi)外顯著增加SKOV3 和A2780 細胞中E-鈣黏蛋白的表達，通過上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達，增加細胞之間的黏附，從而減少卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。
2.6 其他作用機制
TP 抗卵巢癌的作用位點不斷被發(fā)現(xiàn)。分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)與Wnt 受體的胞外區(qū)半胱氨酸富集結(jié)合域同源。SFRP1 與卷曲蛋白結(jié)合形成異二聚體使Wnt受體形成無功能性受體復合物，從而負調(diào)控Wnt 信號通路。Li 等研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1 基因沉默可通過Wnt 途徑激活腫瘤細胞，促進腫瘤細胞的生長，而恢復SFRP1 的表達則可抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。TP 可促進SFRP1 的表達，進而抑制卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移。
白細胞源性精氨酸氨肽酶(leukocyte-derivedarginine aminopeptidase，LRAP)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與內(nèi)源性抗原肽的修飾和遞呈，可促進人白細胞相關抗原I(HLA I)結(jié)合抗原肽;降低白細胞源性精氨酸氨肽酶(LRAP)的表達可修復受損抗原，并幫助腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)控。TP 可上調(diào)LRAP 的表達，通過修整結(jié)合到HLA I 上的抗原肽而使T 淋巴細胞識別并殺滅卵巢癌細胞。
3 結(jié)語
卵巢癌作為嚴重影響女性生命健康的五大惡性腫瘤之一，長期以來都是學術界關注和研究的對象。由于卵巢癌細胞對目前臨床上常用的治療方案存在一定的耐藥性，學者們一直在尋找和開發(fā)療效更為顯著的藥物。TP 是中藥雷公藤的有效成分，其具有廣泛的藥理作用，可多方向、多途徑、交叉發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來將其用于抗卵巢癌的研究引起了廣泛的關注，多項研究證明，TP 對卵巢癌細胞具有抑制細胞增殖、阻斷細胞周期、誘導細胞凋亡以及抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲作用，并且一些傳統(tǒng)化療藥物耐藥的卵巢癌細胞對TP 敏感，其有望成為一種新型的抗腫瘤藥物用于卵巢癌的治療。
目前，TP 抗卵巢癌的作用靶點不斷被發(fā)現(xiàn)，但其抗卵巢癌的作用機制還尚不明確，其臨床應用還受到局限。因此，在現(xiàn)有研究基礎上還需進一步加深對TP 抗卵巢癌作用機制的基礎和臨床研究，以充分發(fā)揮TP 抗卵巢癌的優(yōu)勢，并不斷發(fā)掘藥物聯(lián)用的合理方案，為中藥抗卵巢癌研究提供理論基礎和新思路。
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