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談不同構(gòu)建方法對腎陽虛大鼠模型的影響
腎陽虛大鼠模型是研究中醫(yī)陰陽學(xué)說和補陽藥物作用機制的重要手段，它需要符合中醫(yī)腎陽虛典型癥狀，如精神萎頓、體毛干枯不齊、反映遲鈍等。歷來建模方法各式各樣，然缺乏比較分析，不同建模方法對大鼠的病理生化產(chǎn)生不同的影響，如腺嘌呤構(gòu)建的腎陽虛模型同時也會影響生育，適合研究不育癥。因此，不同建模方法對于中藥藥效評價和機制研究也不同。探索簡便有效的腎陽虛大鼠建模方法，明確其病理生化變化，對藥效學(xué)研究及機制探討具有重要作用。本文報道腺嘌呤和氫化可的松構(gòu)建的腎陽虛大鼠模型腎臟睪丸及SU、Cr、SOD、MDA 的變化，供研究參考。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物SPF 級雄性SD 大鼠21 只，體重180 ～ 200 g，來源: 廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK( 粵) 2013 - 0020。
1. 1. 2 主要試劑及儀器未提純的腺嘌呤Ameresco( 生產(chǎn)批號: 20130325) ，廣州華奇盛生物科技有限公司，氫化可的松( 100mg /20mL，生產(chǎn)批號: 1106021) ，天津金耀氨基酸有限公司?？偝趸锲缁? SOD) 測定試劑盒( WST - 1 法，貨號: A001 - 1，生產(chǎn)批號:201412) 、丙二醛( MDA) 測定試劑盒( TBA 法，貨號:A003 - 1，生產(chǎn)批號: 201412) 、Rat AdrenocorticotropicHormone ( ACTH) Elisa 測定試劑盒( 生產(chǎn)批號:201412) ，南京建成生物工程研究所。BX - 51 型病理圖像采集系統(tǒng)( 日本奧林巴斯公司) 。Labsystems Finnpipette100L 單道移液器; Thermo 50 L 8 道移液器; HH - 4 數(shù)顯恒溫水浴鍋( 國華電器有限公司) ; 華東電子DG5033A 酶標儀( 南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司) 。
1. 2 實驗方法
1. 2. 1 分組與造模按隨機數(shù)字表法把動物分為3組: 空白組( 7 只) 大鼠按2 mL /只皮下注射生理鹽水，連續(xù)10 d。腺嘌呤組大鼠( 7 只) 皮下注射未提純腺嘌呤，劑量0. 2 g / ( kgd) ，連續(xù)10 d。氫化可的松組大鼠( 7 只) 大腿內(nèi)側(cè)肌肉豐厚處注射氫化可的松25mg / ( kgd) ，連續(xù)13 d。
1. 2. 2 一般情況觀測大鼠的活動度、對外界反應(yīng)的靈敏度、皮毛光澤、飲食、飲水、死亡情況。
1. 2. 3 大鼠自主活動度實驗結(jié)束后，將大鼠投入干凈飼養(yǎng)盒中，適應(yīng)3 min 后，計算各鼠2 min 內(nèi)的自由活動時間。
1. 2. 4 大鼠游泳時間自主活動度測量結(jié)束后，將大鼠放入盛滿常溫水的水箱中，測量大鼠放入到開始下沉的時間為游泳時間。
1. 2. 5 標本的采集與制備經(jīng)過12 h 后，摘眼球取血，血液常溫放置1 h 后4 ℃離心機3000 r /min 10 min離心，取血清。大鼠頸椎脫臼處死，取腎臟睪丸觀察并稱重，把腎臟睪丸用10%甲醛溶液固定并放至- 20 ℃冰箱保存，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下進行組織病理學(xué)檢查。
1. 2. 6 指標測定血清尿素采用脲酶- 波氏比色法，血清肌酐采用苦味酸速率法，均通過測定吸光光度值計算。血清SOD 水平采用TBA 法，通過測定OD 值計算; 血清MDA 水平采用WST - 1 法，通過測定吸光光度值計算。
1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法
數(shù)據(jù)用均數(shù) 標準差( 珋x s) 表示，符合正態(tài)分布及方差齊性用方差分析，組間比較采用SNK - q 檢驗，方差不齊采用Dunnett T3 檢驗，P 0. 05 為有顯著性差異。
2 結(jié)果
2. 1 各組大鼠表現(xiàn)空白組大鼠無疲倦，活動正常，飲食量逐漸增加，體重增加。腺嘌呤組大鼠疲倦，飲食量減少，體重減輕，體毛稀疏無光澤，有集群現(xiàn)象。氫化可的松組大鼠飲食量減少，體重減輕，注射部位出現(xiàn)大片脫毛，無光澤，甚至脫皮后結(jié)痂，有集群現(xiàn)象。
2. 2 各組大鼠腎臟睪丸HE 染色結(jié)果空白組大鼠腎臟睪丸表面色澤鮮紅，腎皮質(zhì)與腎髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰、分界清晰，生精小管排列緊密，間質(zhì)細胞豐富，生精小管內(nèi)的生精細胞排列規(guī)則，層次清晰，精子數(shù)目多。腺嘌呤組腎臟表面色澤鮮紅，體積略增大，腎皮質(zhì)略微固縮，腎小管管腔變窄，腎間質(zhì)水腫、充血伴明顯的炎性細胞浸潤; 睪丸生精小管萎縮變性，排列疏松，間質(zhì)退化、細胞減少，各級生精細胞排列松散，不規(guī)則，精子數(shù)量較少。氫化可的松組腎臟表面色澤鮮紅，腎皮質(zhì)固縮不明顯，與腎髓質(zhì)分界清晰，腎間質(zhì)有炎性細胞浸潤; 睪丸生精小管略萎縮，排列疏松，各級生精細胞排列松散，不規(guī)則。
2. 3 大鼠臟器指數(shù)、自主活動度和游泳時間與空白組比較，腺嘌呤、氫化可的松組大鼠腎臟和睪丸指數(shù)均增大( P 0. 05) ，自主活動度游泳時間均較低( P 0. 05) ; 且與比腺嘌呤組比較，氫化可的松組睪丸指數(shù)高( P 0. 05) ，自主活動度低( P 0. 05) 。
2. 4 大鼠血清尿素、肌酐水平和SOD、MDA 活力與空白組比較，腺嘌呤組大鼠血清肌酐、SOD 和MDA 活力均增高( P 0. 05) ，氫化可的松組大鼠血清肌酐、SOD 活力均降低( P 0. 05) ，MDA 活力增高( P 0. 05) ; 且氫化可的松組血清肌酐和SOD 活力均比腺嘌呤組低( P 0. 05) 。
3 討論
陽虛動物建模需要與臨床復(fù)雜的證候相一致，構(gòu)建符合臨床實際的動物模型對于方藥研究有著重要作用。腎陽虛動物模型作為研究補陽藥物或方劑的重要手段，目前診斷標準主要采用《中醫(yī)虛證辨證參考標準》，依據(jù)動物的外觀、行為等來評判其吻合程度，以確定模型成功與否。本研究發(fā)現(xiàn)腺嘌呤或氫化可的松建模，動物均表現(xiàn)出疲倦，飲食量少，體重減輕，體毛稀疏無光澤，反應(yīng)遲鈍，自主活動度降低，游泳時間短等癥狀，中醫(yī)認為此乃陽氣不振，陰寒內(nèi)盛，神失所養(yǎng)。陽氣不振，溫煦推動功能減弱，血脈運行不暢，經(jīng)絡(luò)失養(yǎng)，發(fā)于皮毛則體毛稀疏無光澤; 影響運化之力，則飲食量少，體重減輕; 無力升騰，則神失所養(yǎng)，疲倦萎靡。《黃帝內(nèi)經(jīng)》提到陽主動，陰主靜，因此，自主活動度減少，游泳時間減少乃機體陽虛狀態(tài)。故兩種建模方法從臨床表現(xiàn)和行為上，均符合腎陽虛證。血清肌酐( Cr) 由外源性和內(nèi)源性組成，當(dāng)腎實質(zhì)損害，腎小球濾過率( GFR) 降低到正常的1 /3 時，Cr就會明顯上升; 尿素是蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物之一，在肝中經(jīng)鳥氨酸循環(huán)生成，進入血液循環(huán)由腎臟排泄，當(dāng)腎實質(zhì)受到損害時，GFR 降低，血清尿素( SU) 濃度升高。本研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤組大鼠腎臟出現(xiàn)腎皮質(zhì)略微固縮，腎小管管腔變窄，腎間質(zhì)水腫、充血伴明顯的炎性細胞浸潤等病理變化，同時與空白組比較，Cr 水平明顯升高，SU 有升高趨勢，說明腺嘌呤建模會影響腎小球濾過功能。另外，有研究認為，氫化可的松可促進機體能量的過度消耗，從而出現(xiàn)一系列耗竭現(xiàn)象，即拱背蜷曲，集群，游泳時間縮短等。由于本研究中氫化可的松組大鼠飲食量減少，機體能量又過度消耗，導(dǎo)致肌酐生成的外源和內(nèi)源途徑均減少，可能是其Cr 降低的原因。具體原因有待進一步研究。SOD 是細胞抗氧化酶促防御系統(tǒng)，當(dāng)體內(nèi)自由基生成增多時，SOD 可清除超氧陰離子，從而保護細胞免受傷害，故SOD 反映了細胞的自我保護能力。MDA 是自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，當(dāng)細胞受到氧自由基攻擊從而引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，就會產(chǎn)生大量MDA 損傷細胞膜，進而使細胞死亡。有研究表明，SOD、MDA 參與腎損傷的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，腺嘌呤組SOD 和MDA 活力均增高，考慮大鼠自身能量未被消耗，抵抗能力較強，但其引起腎小球濾過率降低等病理改變，使自由基產(chǎn)生增多，細胞受到氧自由基攻擊，故兩者均增高。而氫化可的松組SOD 活力降低和MDA 活力增高，與以往研究相同，可能是由于氫化可的松一方面過度消耗機體能量，抵抗外來損害能力減弱，另一方面它又對腎臟睪丸有一定損害作用，自由基產(chǎn)生增多，細胞受到氧自由基攻擊反應(yīng)，從而使SOD 降低、MDA 升高。具體原因有待進一步研究。綜上，腺嘌呤與氫化可的松構(gòu)建腎陽虛模型在虛證表現(xiàn)和腎臟睪丸病變上相似，但作用方式不同，腺嘌呤可能是通過損害腎濾過水平、睪丸生理功能等引起血清肌酐、SOD 和MDA 活力升高，氫化可的松則可能是通過耗散機體能量，減弱機體抵抗能力，影響血清肌酐生成、降低SOD 活力和增高MDA 活力，具體原因有待進一步探究。
談參七抗癌散抗腫瘤及其鎮(zhèn)痛作用
參七抗癌散[醫(yī)院制劑批號：(98)A11-021]源于武漢科德中醫(yī)醫(yī)院張德忠老中醫(yī)祖?zhèn)髅胤剑?002年獲武漢市科技進步三等獎，并獲發(fā)明專利1項(專利號：ZL 02117062.2)。本方由西洋參、三七、半枝蓮、南柴胡、白花蛇舌草、夏枯草、甘草、當(dāng)歸、白芍、枳殼組成，具有益氣活血、軟堅散結(jié)、解毒止痛之功效。張德忠院長使用其祖?zhèn)髅胤脚R床用于治療腫瘤疾患40余年，治療腫瘤患者數(shù)千例，大多為肺癌患者，能改善患者癥狀，控制腫瘤發(fā)展，減輕病人痛苦，提高生存質(zhì)量，具有較好的療效，受到廣大患者歡迎。在臨床療效的基礎(chǔ)上，武漢市科德中醫(yī)醫(yī)院與湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥化學(xué)省級重點實驗室產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，擬將該醫(yī)院制劑研制成中藥新品種。針對參七抗癌散的主治功效和臨床療效，本文對該制劑抗腫瘤活性和鎮(zhèn)痛作用進行了藥效學(xué)試驗研究，取得了良好的試驗效果，從而為其臨床療效提供了一定科學(xué)依據(jù)，也為將其開發(fā)中藥新品種提供了參考。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 供試藥物
參七抗癌散由武漢市科德中醫(yī)醫(yī)院提供。1.1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Labsystems);酶標儀(Forma Series Ⅱ Water Jacketed);DLSB-5/20低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州奧華儀器有限公司)。
1.1.3 試劑
胎牛血清FBS(Gibco);RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone)，MTT (Sigma);5-氟尿嘧啶(5-Fu，Santa);胰蛋白酶;DMSO;鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：120418-1);乙酰水楊酸(中國上海森灝精細化有限公司，99.5%-101.0%);冰乙酸(天津永大化學(xué)試劑有限公司);氯化鈉注射液(開開援生制藥股份有限公司，批號13100123);均為分析純。
1.1.4 細胞
人非小細胞肺腺癌細胞株A549，由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。
1.1.5 動物
SPF級昆明小鼠，18-22g，由湖北省實驗動物研究中心提供。實驗動物使用許可證號：SCXK(鄂)2008-0005，置于湖北中醫(yī)藥大學(xué)標準動物中心飼養(yǎng)。
1.2 方法
1.2.1 供試藥物制備
取一定量的參七抗癌散，傾出內(nèi)容物，精密稱取30g，加8倍量70%乙醇回流提取兩次，每次1h，合并濾過溶液，回收乙醇至無醇味，加適量水稀釋;首先用石油醚多次萃取，殘留水液堿化后用氯仿多次萃取，殘留水液酸化后再用乙酸乙酯多次萃取，殘留水液繼續(xù)用正丁醇多次萃取，剩下為殘余水液;各萃取液分別減壓回收溶劑，得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶性物質(zhì);各提取物分別用DMSO溶解備用。
1.2.2 MTT法篩選
參七抗癌散有效部位取處于對數(shù)生長期，狀態(tài)良好A549細胞制成單細胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板，以10%的FBS和1640培養(yǎng)液置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，至細胞長至80%，分別加入?yún)⑵呖拱┥⒌墓┰嚻匪幰?濃度均為100g/ml)，每個樣品設(shè)6個復(fù)孔，然后再置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，設(shè)空白對照組和陽性藥物對照組(5-Fu，80g/ml)。藥物作用時間完成后，棄去96孔板中細胞培養(yǎng)液，分別向96孔板中加入5mg/ml MTT溶液，每孔10l，置入培養(yǎng)箱中孵育4h。最后加入100l/孔的DMSO溶液終止反應(yīng)，用酶標儀在570nm測OD值，實驗重復(fù)3次，用SPSS 19.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，ANOVA法進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以珔xs表示。按以下公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=[1-(實驗組OD值-空白對照OD值)/(細胞對照OD值-空白對照OD值)]100%。
1.2.3 MTT法測定
參七抗癌散提取物氯仿部位不同濃度抗腫瘤作用 按上述同樣方法將A549細胞接種至96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，分別加入?yún)⑵呖拱┥⒙确螺腿∥锊煌瑵舛鹊墓┰囁幬?，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，設(shè)4個濃度梯度，加入細胞培養(yǎng)板后的終質(zhì)量濃度分別為70，90，100，110g/ml，每孔100l。然后再置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，空白對照組和陽性對照組設(shè)置同1.2.2。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法同1.2.2，結(jié)果以珔xs表示。
1.2.4 參七抗癌散對小鼠醋酸刺激致痛的影響
取體重18-22g SPF級小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組：①生理鹽水組：生理鹽水0.1ml/10g;②阿司匹林組：100mg/kg;③參七抗癌散低劑量組：2.4g/kg;④參七抗癌散中劑量組：4.8g/kg;⑤參七抗癌散高劑量組：9.6g/kg。各組按10ml/kg灌胃給藥1次/d，連續(xù)7d。末次給藥30min后，各組小鼠按10ml/kg腹腔注射0.8%乙酸，記錄注射乙酸后15min內(nèi)各組小鼠出現(xiàn)的扭體反應(yīng)動物數(shù)，并計算鎮(zhèn)痛百分率。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用ANOVA分析法，結(jié)果用珔xs表示。
1.2.5 參七抗癌散對小鼠熱刺激的影響選用18-22g雌性小鼠，放入(550.5)℃恒溫水浴板上，測定其痛閾值(小鼠足部接觸熱板到開始舔后足的時間為痛閾值，以不超過30s為合格)。選擇合格的小鼠50只，隨機分5組：①生理鹽水組：生理鹽水0.1ml/10g;②鹽酸嗎啡組;100mg/kg;③參七抗癌散低劑量組：2.4g/kg;④參七抗癌散中劑量組：4.8g/kg;⑤參七抗癌散高劑量組：9.6g/kg。各組按0.2ml/10g灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7d。末次給藥30min后，測定給藥后15min、30min、60min、90min各鼠的痛閾值(如超過60s，則按60s計算)。
1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析
實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組與其給藥前采用t檢驗，給藥后各組間重復(fù)測量采用ANOVA分析法，結(jié)果用珔xs表示，以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 有效物質(zhì)部位的篩選
與空白對照組比較，參七抗癌散中顆粒醇提物和氯仿萃取物對A549細胞具有明顯的抑制作用，且氯仿萃取物抑制作用極為顯著(P0.01)，其他萃取物質(zhì)部位對腫瘤細胞抑制不明顯，故可以推斷該膠囊抗腫瘤有效物質(zhì)主要集中于氯仿萃取物質(zhì)部位。
2.2 不同濃度氯仿萃取物質(zhì)部位抗腫瘤作用
可知與空白對照組比較，參七抗癌散氯仿萃取物對A549細胞抑制率較好且抑制率顯著(P0.01)，且隨著濃度的升高而升高，呈劑量依賴性。
2.3 醋酸刺激扭體反應(yīng)
實驗結(jié)果表明，參七抗癌散能減少醋酸所致小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)，與對照組(NS)比較，其高劑量組呈顯著性差異(P0.05)，提示參七抗癌散對乙酸所致小鼠的疼痛性反應(yīng)有較好的對抗作用。
2.4 熱板刺激反應(yīng)
實驗結(jié)果表明，與對照組(NS)比較，參七抗癌散能提高小鼠的痛閾值，其高劑量組具有顯著性差異(P0.05)，提示參七抗癌散對熱刺激所致小鼠的疼痛性反應(yīng)具有較好的對抗作用。
3 討論
3.1 本論文對參七抗癌散抗腫瘤的有效物質(zhì)部位進行了篩選研究。采用溶劑法與調(diào)節(jié)pH 值相結(jié)合的萃取方法，將該制劑提取分離為乙醇粗提物，石油醚萃取物質(zhì)部位(脂溶性物質(zhì))、氯仿萃取物質(zhì)部位(堿性物質(zhì))、乙酸乙酯萃取物質(zhì)部位(酚酸性物質(zhì))、正丁醇萃取物質(zhì)部位(苷類物質(zhì))和水溶性物質(zhì)部位?？鼓[瘤活性篩選結(jié)果表明氯仿萃取物質(zhì)部位和乙醇粗提物對肺腺癌A549具有明顯抑制作用，其他物質(zhì)部位未呈現(xiàn)明顯活性，從而確定為參七抗癌散抗腫瘤活性物質(zhì)部位。進一步研究表明該有效物質(zhì)部位對A549細胞的抑制率呈現(xiàn)劑量依賴性。因此，本項研究結(jié)果為參七抗癌散抗腫瘤作用的臨床療效提供了現(xiàn)代藥理學(xué)實驗依據(jù)。該制劑抗腫瘤有效物質(zhì)部位化學(xué)成分的分離鑒定、活性篩選及作用機理正在研究中，以期詮釋其抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
3.2 據(jù)文獻報道，腫瘤患者的劇烈疼痛與前列腺素E2和一氧化氮(NO)的高表達及其含量有關(guān)，前列腺素E2的含量與腫瘤大小、分期和有無轉(zhuǎn)移相關(guān)。NO作為一種調(diào)節(jié)細胞多功能的信息分子，對外周及中樞神經(jīng)痛覺機制中發(fā)揮重要作用。鳳良元等報道了中藥復(fù)方芍藥甘草湯具有良好的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用機制與前列腺素E2和NO等化學(xué)物質(zhì)有關(guān)。本論文研究表明，參七抗癌散具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，該制劑處方中含有芍藥和甘草(2∶1)藥對，其鎮(zhèn)痛機制推測由該藥對能抑制前列腺素E2的合成和降低血細胞中NO的含量。
3.3 參七抗癌散制劑臨床治療腫瘤患者數(shù)千例，效果良好。本論文采用現(xiàn)代藥理學(xué)方法對其抗腫瘤生物活性和鎮(zhèn)痛作用進行了研究，取得了良好的預(yù)期效果，從而為該醫(yī)院制劑的臨床療效提供了藥效學(xué)實驗依據(jù)，并為其開發(fā)中藥新藥品種奠定了一定基礎(chǔ)。
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