與醫(yī)學(xué)相關(guān)的論文的范文大全精選
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從P38-MAPK 信號(hào)通路討論
黃芩苷對(duì)Ac-LDL+LPS誘導(dǎo)的與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)巨噬細(xì)胞凋亡的影響動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)相關(guān)心血管疾病的發(fā)生與AS 斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞是不穩(wěn)定斑塊的主要細(xì)胞成分，其凋亡與As斑塊的破裂相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞凋亡的結(jié)果在AS 的早期和晚期是不同的。早期病變中，巨噬細(xì)胞的凋亡有利于抑制病變細(xì)胞泡沫化，顯著降低早期病變面積。晚期巨噬細(xì)胞凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂密切相關(guān)。
p38 蛋白激酶通路是已確定的 MAPKs 家族成員之一，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育以及細(xì)胞間功能同步等多種生理過(guò)程，并與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)。p38 MAPK通路也參與介導(dǎo)凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡。
黃芩苷(baicalin)是由黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一。近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。然而對(duì)黃芩苷抗AS 的作用機(jī)制并沒(méi)有明確的闡明。通過(guò)整體及離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)肺炎衣原體感染所致AS 病理過(guò)程具有良好的阻抑作用。本實(shí)驗(yàn)以脂多糖和乙酰低密度脂蛋白雙重打擊誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞凋亡，觀察黃芩苷對(duì)凋亡及凋亡相關(guān)P38 MAPK信號(hào)通路的影響，從巨噬細(xì)胞凋亡信號(hào)通路方面論證黃芩苷干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 材料
RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中山醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心;0.25% 胰酶、DMEM 培養(yǎng)液、脂多糖、培養(yǎng)瓶、PBS、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自廣州斯佳生物科技有限公司;乙酰低密度脂蛋白、脂多糖、黃芩苷、AnnexinV FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Westernblot 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州晨展生物公司。
1.2 巨噬細(xì)胞的收集及試驗(yàn)分組
RAW264.7細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含100 g/mL青鏈霉素、10% 胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度中培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。黃芩苷劑量參照鄺氏實(shí)驗(yàn)，乙酰低密度脂蛋白用量參照Venkateswaran A實(shí)驗(yàn)，脂多糖用量參照萬(wàn)氏實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)分為7組，即為(1)正常組：巨噬細(xì)胞采用原培養(yǎng)基孵育;(2)乙酰低密度脂蛋白對(duì)照組：原培養(yǎng)基中吸出125 L 上清液，加入100 g/mL Ac-LDL 125 (3)脂多糖對(duì)照組：原培養(yǎng)基中吸出50 L 上清液，加入1 g/mL LPS 50 (4)模型組：原培養(yǎng)基中吸出175L上清液，加入100 g/mL Ac-LDL125g/mL LPS 50(5)低劑量觀察組：原培養(yǎng)基中吸出275L 上清液，加入100 g/mLAc-LDL 125L +1 g/mL LPS 50L +120 g/mL黃芩苷含藥血清100(6)中劑量觀察組：原培養(yǎng)基中吸出275L 上清液，加入100 g/mL Ac-LDL 125L +1 g/mL LPS 50L +240 g/mL 黃芩苷含藥血清100(7)高劑量觀察組：原培養(yǎng)基中吸出275L上清液，加入100 g/mL Ac-LDL125g/mL LPS 50L +480 g/mL黃芩苷含藥血清100L。
1.3 AnnexinVFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)
用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5105 個(gè)/mL，接種于24 孔板，待細(xì)胞貼壁后，分組方法同前，刺激物加入24 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，PBS洗2 次，按試劑盒說(shuō)明書要求染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
1.4 Western-blot檢測(cè)P38的表達(dá)
另取細(xì)胞接種于12 孔板，待細(xì)胞貼壁后，分組方法同1.2項(xiàng)下，刺激物加入 4 h 后，加入細(xì)胞裂解液，采用Western - blot 法檢測(cè)P38-MAPK 含量。具體步驟如下：將細(xì)胞收集裂解后進(jìn)行丙稀酰胺凝膠電泳，電泳后，將膠上的 DNA 轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，PVDF膜用封閉液封閉之后，TBST 液洗膜 3 次，并分別加入鼠P38 4 ℃過(guò)夜。并用鼠 GAPDH 單抗(一抗)作為內(nèi)參照。TBST 液再洗膜 3 次后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫振蕩 2 h，洗膜后，加入LumiGLO 底物，對(duì)X 膠片(Kodak，日本)適度曝光后，顯影，定影。
1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)JNK蛋白表達(dá)
使用qRT-PCR法，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書完成。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析__(ANOVA)模塊，組間比較采用t 檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
正常組、對(duì)照組與模型組的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)，模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組和對(duì)照組，可知實(shí)驗(yàn)造模成功。黃芩苷低劑量觀察組與模型組細(xì)胞凋亡率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)。黃芩苷中、高劑量觀察組與模型組細(xì)胞凋亡率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)，黃芩苷中、高劑量觀察組細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組，而高劑量觀察組細(xì)胞凋亡率又高于中劑量觀察組。結(jié)果見表1。以Annexin-FITC和PI(propidium，碘化丙錠)雙標(biāo)法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)RAW264.7 巨噬細(xì)胞凋亡率。
2.2 Western-blot檢測(cè)磷酸化P38的表達(dá)
常規(guī)培養(yǎng)基孵育的巨噬細(xì)胞(正常組)中有少量磷酸化P38 表達(dá)，定義為1。在Ac-LDL、LPS、Ac-LDL+LPS的干預(yù)下，磷酸化P38 表達(dá)皆升高。乙酰低密度脂蛋白對(duì)照組與脂多糖對(duì)照組磷酸化P38 相對(duì)表達(dá)量為：2.0、1.2，模型組中磷酸化P38表達(dá)明顯，為2.2。這表明在Ac-LDL、LPS、Ac-LDL+LPS的干預(yù)下磷酸化P38 表達(dá)水平皆增加，Ac-LDL+LPS模型組最明顯，證明建模成功。經(jīng)過(guò)黃芩苷的處理，低、中、高劑量觀察組磷酸化P38 表達(dá)量分別為1.8、1.6、3.8。可見，Ac-LDL+LPS聯(lián)合打擊較Ac-LDL或LPS單獨(dú)干預(yù)的巨噬細(xì)胞中P38 高。黃芩苷低、中劑量觀察組對(duì)磷酸化p38表達(dá)無(wú)明顯的促進(jìn)或抑制作用，高劑量觀察組磷酸化P38 表達(dá)量明顯增高。
3 討論
本實(shí)驗(yàn)采用乙酰低密度脂蛋白及脂多糖雙重打擊誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在LPS復(fù)合高脂條件下培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞凋亡顯著增加，正常組、對(duì)照組與模型組的細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)，模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組和對(duì)照組，可知實(shí)驗(yàn)造模成功。在巨噬細(xì)胞凋亡顯著增加的同時(shí)，模型組也出現(xiàn)了較高水平磷酸化P38 的表達(dá)，這說(shuō)明脂多糖和乙酰低密度脂蛋白雙重打擊是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的重要原因，P38-MAPK信號(hào)通路參與這一過(guò)程。黃芩苷高劑量觀察組與模型組細(xì)胞凋亡率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)，同時(shí)黃芩苷高劑量組磷酸化P38 表達(dá)明顯增強(qiáng)，較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見，高劑量的黃芩苷可能通過(guò)激活P38 通路促進(jìn)早期AS斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡。黃芩苷中劑量觀察組與模型組細(xì)胞凋亡率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，黃芩苷低、中劑量組磷酸化P38 表達(dá)較模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，隨著黃芩苷濃度的上升，細(xì)胞凋亡率升高。高劑量的黃芩苷可能通過(guò)激活P38-MAPK信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，而具體激活P38MAPK信號(hào)通路的最小劑量有待進(jìn)一步研究。中量黃芩苷組磷酸化P38 表達(dá)較模型組無(wú)計(jì)學(xué)意義，但其仍促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡，考慮中劑量黃芩苷可能通過(guò)JNK、SRA 等其他通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，需進(jìn)一步研究以闡明。
動(dòng)脈粥樣硬化斑塊越不穩(wěn)定，越易破裂，斑塊破裂后易導(dǎo)致血栓形成。而巨噬細(xì)胞是不穩(wěn)定斑塊的主要細(xì)胞成分。巨噬細(xì)胞凋亡在AS 發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，它貫穿了AS整個(gè)過(guò)程。Tracie 等[17-18] 用多種基因敲除動(dòng)物模型深入研究了FC 引起巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)主要需要3個(gè)通路的同時(shí)作用，這3 個(gè)通路分別為氨基端激酶(JNK)通路、P38-UPR-CHOP通路和A 型清道夫受體(SRA)通路。P38 表達(dá)與巨噬細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系[19-20]。近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者以LPS 和乙?；兔芏戎鞍?Ac-LDL)加?；o酶A- 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶抑制劑(58035)條件成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，大量研究也發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。然而對(duì)黃芩苷抗AS 的作用機(jī)制并沒(méi)有明確的闡明。馬珺等研究顯示黃芩苷可以通過(guò)調(diào)節(jié)血脂及抗氧化作用對(duì)AS 起到干預(yù)作用;于昕等研究提示黃芩苷可能通過(guò)降血脂、改善凝血纖溶系統(tǒng)平衡、下調(diào)凝血酶激活纖溶抑制物(TAFI)水平等途徑干預(yù)AS 的形成;吳偉等研究證明黃芩苷可以明顯降低血清TNF、IL-6 及IL-10 水平，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮其對(duì)AS 的早期干預(yù)作用;李巖等研究提示黃芩苷可能通過(guò)抗炎作用發(fā)揮其對(duì)AS的干預(yù)作用。
在動(dòng)脈粥樣硬化早期的病變中(即壞死核心發(fā)展之前)，巨噬細(xì)胞凋亡與病灶大小呈反比關(guān)系，巨噬細(xì)胞的凋亡有利于抑制病變細(xì)胞泡沫化，顯著降低早期病變面積。早期病變巨噬細(xì)胞死亡的有益方面已經(jīng)用缺陷鼠來(lái)闡明，AIM-/- 和LDLR-/- 雙敲除鼠表明增加了巨噬細(xì)胞的死亡，可顯著降低早期病變面積。也有研究發(fā)現(xiàn)，在病變?cè)缙赱23-24]，巨噬細(xì)胞吞噬功能很強(qiáng)，主要針對(duì)脂蛋白，也可有效吞噬清除凋亡細(xì)胞，限制活體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化病變的大小，而在此過(guò)程中巨噬細(xì)胞本身也遭受凋亡細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的影響而發(fā)生凋亡，可見在動(dòng)脈粥樣硬化病變?cè)缙诰奘杉?xì)胞凋亡是減少病變成分，抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的表現(xiàn)。
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，綜合當(dāng)前研究現(xiàn)狀，高劑量的黃芩苷可能通過(guò)激活P38 MARK 信號(hào)通路促進(jìn)早期AS 斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡，抑制病變細(xì)胞泡沫化，減少病變成分，降低病變面積從而拮抗早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理進(jìn)程。低劑量黃芩苷的作用不明顯，提示較高濃度的黃芩苷才能激活相關(guān)通路，發(fā)揮拮抗早期動(dòng)脈粥樣硬化的作用。隨著如血管內(nèi)超聲成像等各種檢測(cè)技術(shù)的日益完善，我們可以更多的從黃芩苷促進(jìn)早期AS 斑塊巨噬細(xì)胞凋亡方面入手，深入研究黃芩苷的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，利用黃芩苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞凋亡進(jìn)行更有利的調(diào)控，為早期有效干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展提供新的治療靶點(diǎn)。
當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 抑制作用機(jī)制的討論
當(dāng)歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原為治療妊娠小便難，具有活血補(bǔ)血，化痰散結(jié)，清熱解毒的功效。與腫瘤的發(fā)病正氣不足，痰( 濕) 濁、熱毒、瘀血內(nèi)阻有著共同機(jī)制。近年來(lái)以用其加味治療宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌取得明顯療效。其中絕大多數(shù)研究都是針對(duì)下焦癌變進(jìn)行，而本研究拓展思路，將研究目光轉(zhuǎn)向中焦胃癌。從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)環(huán)氧化酶( cyclooxygenase，COX) ，Bcl-2 相關(guān)X 蛋白( Bcl-2 associated Xprotein，Bax ) ，抑癌基因( phosphatase and tensinhomolog deleted on chromosome ten，PTEN) ，在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，探討當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901 的機(jī)制，為中醫(yī)藥經(jīng)方抗腫瘤研究提供理論基礎(chǔ)。
1 材料
1. 1 動(dòng)物及細(xì)胞
株SPF 級(jí)Waster 大鼠，合格證號(hào)SCXK( 甘) 2011-0001，體重( 180 20) g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。飼養(yǎng)條件: 室溫20 ～ 25 ℃，濕度45% ～ 55%。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，食標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲水自由，飼料由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。人胃癌SGC-7901 細(xì)胞株購(gòu)于北京協(xié)和腫瘤研究所。
1. 2 藥物及試劑
當(dāng)歸、貝母、苦參購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清( 美國(guó)HyClone 公司) ，四甲基偶氮唑藍(lán)( 上海華舜生物工程有限公司) ，二抗( 中杉金橋生物技術(shù)有限公司) ，RNAisoTMPlus( 批號(hào)D9810A) ， the PrimeSeript RTreagent，kit( 批號(hào)DRRO37A) ，SYBR Premix Ex TaqTM( 批號(hào)DRR081A，英國(guó)TakarBio 公司) ，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭? 北京化學(xué)試劑公司) 。
1. 3 儀器
SW-CJ-1D 型超凈工作臺(tái)( 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司) ，MCO-18AIC 型CO2培養(yǎng)箱( 日本三洋公司) ，CKX41 /U-RFLT50 型熒光倒置顯微鏡( 日本Olympus 公司) ，5804R 型高速冷凍離心機(jī)( 德國(guó)Eppendorf 公司) ，Bio-Rad CFX96 型熒光PCR儀( 美國(guó)伯樂(lè)公司) 。
2 方法
2. 1 含藥血清制備
2. 1. 1 中藥湯液制備將各復(fù)方中藥藥物飲片浸泡1 h，煎煮2 次，每次30 min，紗布粗濾去渣，藥液濃縮為含生藥1，2，3gmL - 1。
2. 1. 2 給藥劑量方式及采血方法按完全隨機(jī)化分組方法，將120 只大鼠分為當(dāng)歸貝母苦參丸高、中、底劑量組和空白空白組，每組30 只，中藥組和空白組大鼠每天分別灌服中藥和生理鹽水0. 01 mLg - 1，2 次/d，均連續(xù)給藥7 d，正常飲食飲水。對(duì)每只大鼠于末次給藥2 h 后，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈采血，3 000 rmin - 1，15 min 離心分離血清，將各組已取備的30 支血清混合，0. 22 m 微孔濾膜過(guò)濾，56 ℃，30 min 滅活，- 80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2. 2 細(xì)胞培養(yǎng)人
胃癌細(xì)胞株SGC-7901 接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，其中1 組加入空白大鼠血清，其中1 組加入10%胎牛血清作為空白組，用于檢驗(yàn)空白大鼠血清的特異性，其他3 組加入不同濃度的含藥血清;每組都加入含雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0. 25% 胰酶，37 ℃ 條件下消化，吹打成細(xì)胞懸液后接種傳代。
2. 3 MTT 法檢測(cè)
細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)狀態(tài)好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備成密度為5 104 /mL 細(xì)胞懸液。96 孔板每孔加入細(xì)胞懸液100 L，細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的含藥血清與培養(yǎng)液，空白組加入等量的完全培養(yǎng)液，每個(gè)劑量設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。于24，48，72 h 后，各取一塊96 孔培養(yǎng)板，每孔加入濃度為5 gL - 1 的MTT 20 L。4 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150 L，搖床震蕩10 min，酶聯(lián)儀于570 nm 處測(cè)出各孔吸光度A，按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率= ( A空白組- A給藥組/A空白組) 100%。
2. 4 RT-qPCR 檢測(cè)
COX-2，Bax，PTEN 的mRNA 表達(dá)水平總RNA 提取: 分別將空白血清和含藥血清處理24 h 的SGC-7901 細(xì)胞用PBS 清洗2 次，加入預(yù)冷的Trizol 1 mL，冰上靜置10 min，使用細(xì)胞刮刮除細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至RNA 酶處理過(guò)的1. 5 mL EP 管中，加入0. 2 mL 三氯甲烷，劇烈混勻，冰上靜置5 min;4 ℃，12 000 rmin - 1離心，15 min; 之后可見分層，小心吸取上清約0. 5 mL; 加入0. 5 mL 異丙醇，上下混勻，冰上靜置10 min; 4 ℃，10 500 rmin - 1 離心10 min，可見核酸沉淀，棄上清，加入75%乙醇溶解;4 ℃，8 500 rmin - 1 離心5 min，棄上清; 干燥5 min后加入適量DEPC 水，存于- 80 ℃。提取RNA 進(jìn)行濃度純度檢測(cè)后，用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用CFX96 Real-Time 熒光PCR 儀擴(kuò)增目的基因。COX-2 上游引物3-GCCTGAATGTGCCATAAGACTG-5，下游引物3-AAACCCACAGTGCTTGACACA-5 Bax 上游引物3-GGATGCGTCCACCAAGAAG-5， 下游引物3-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA-5 PTEN 上游引物3-GACTCTGGAATATCCCTGGACA-5，下游引物3-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-5。采用熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明操作，使用CFX96 Real-Time 熒光PCR 儀擴(kuò)增，條件為: 95 ℃10 s 預(yù)變性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s 40 個(gè)循環(huán)分析溶解曲線，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采取2 - Ct法計(jì)算。
2. 5 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)
COX-2，Bax，PTEN 蛋白量的表達(dá)在24 孔培養(yǎng)板中每孔置入無(wú)菌10 mm 10 mm 的蓋玻片，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC-7901 細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接種于24 孔培養(yǎng)板中，每孔500 細(xì)胞貼壁后，空白組加入50 L完全培養(yǎng)基，余孔加入空白血清、高、中、低含藥血清各50 L，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞爬滿蓋玻片后，將爬片置于4% 多聚甲醛中過(guò)夜，PBS 洗3次，5min /次; 滴加50 L 0. 1% Triton X-100 室溫下孵育15 min，PBS 洗3 次，5 min /次; 滴加3% H2O2室溫下孵育30 min，PBS 洗3 次，5min /次; 滴加50L 5%BSA 封閉液，室溫20 min，甩去多余液體; 滴加50 L 稀釋過(guò)的Rabbit Anti-collagen Type Ⅱ( 1∶ 100) ，濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜; 以PBS 代替一抗，作為陰性對(duì)照，PBS 洗3 次，2min /次; 滴加生物素化山羊抗兔IG， 37 ℃ 20 min，PBS 洗3 次，2min /次; 滴加試劑SABC，37 ℃ 20 min，PBS 洗4 次，5min /次;DAB 顯色，自來(lái)水沖洗1 min; 蘇木素復(fù)染5 min，0. 5%鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍(lán)10 s; 梯度乙醇( 70%，75%，80%，85%，95%，100%) 脫水干燥，每一個(gè)梯度5 min，二甲苯透明10 s，甘油封片。倒置相差顯微鏡觀察照相。每張爬片選擇3 個(gè)高倍視野，使用圖像費(fèi)你先軟件對(duì)所拍照片進(jìn)行分析，測(cè)定相對(duì)灰度值。
2. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以珋x s 表示，多組間采用單因素方差分析，以P 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3. 1 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞增殖抑制的影響
MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力，空白血清組與空白組相比較，差異不大，所以在下列比較過(guò)程中將把空白組作為基準(zhǔn)組。發(fā)現(xiàn)10%濃度的當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901 細(xì)胞抑制作用最明顯，與空白組比較，含藥血清高、中、低組細(xì)胞的A 明顯降低，SGC-7901細(xì)胞組72 h 的抑制率分別為: 高劑量組達(dá)到35. 21%，中劑量組為32. 39%，低劑量組為21. 12%; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0. 05) 。
3. 2對(duì)SGC-7901 細(xì)胞
COX-2，Bax，PTEN 蛋白表達(dá)的影響COX-2 在空白組主要以強(qiáng)陽(yáng)性和陽(yáng)性表達(dá)為主，在含藥血清干預(yù)組中，細(xì)胞著色逐漸變淺，COX-2 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率由與空白組相比明顯下降; 促凋亡基因Bax 在空白組中呈陰性或是弱陽(yáng)性表達(dá)，在含藥血清干預(yù)組中，細(xì)胞著色逐漸變深，呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，Bax 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與空白組相比上升; 抑癌基因PTEN 蛋白著色逐漸變深，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，而空白組細(xì)胞著色較淺，呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)。
4 討論
胃癌是我國(guó)常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居各類腫瘤的首位，因?yàn)樵缙谖赴o(wú)特異性的癥狀，所以大多數(shù)患者在就診時(shí)就已到中晚期，而此時(shí)預(yù)后效果極差，常常因?yàn)樾g(shù)后復(fù)發(fā)或癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移而擴(kuò)散到其他部位而死亡。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是癌基因激活與抑癌基因受抑制的結(jié)果，并受相關(guān)基因的影響，其mRNA 與蛋白的表達(dá)量亦影響癌細(xì)胞的發(fā)展與惡性腫瘤的預(yù)后。本研究從COX-2，Bax，PTEN 3 個(gè)不同方向的相關(guān)基因探討抑制腫瘤的機(jī)制，為尋找新的藥物對(duì)其作用加以調(diào)控可能對(duì)胃癌治療帶來(lái)新的策略。
COX 是前列腺素( PGs) 合成的關(guān)鍵限速酶。COX-2 的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，研究表明表達(dá)COX-2 的細(xì)胞能夠直接附著于基底膜，破壞基底膜的完整性，從而改變細(xì)胞的黏附性，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。Hp 黏附于胃黏膜上皮，其釋放的毒力因子直接與上皮細(xì)胞接觸，而胃黏膜上皮損傷誘導(dǎo)COX-2 表達(dá)Hp 感染可刺激誘導(dǎo)COX-2 的白細(xì)胞介素8( IL-8) ，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( VEGF) 等因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清作用于胃癌細(xì)胞可以明顯降低COX-2 的表達(dá)量，推測(cè)可通過(guò)抑制COX-2 的表達(dá)降低細(xì)胞間黏附的E-鈣黏蛋白活性，減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Bax 基因是Bcl-2 基因家族內(nèi)的同源基因，Bax基因表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Bax 缺失在腫瘤的發(fā)生中起重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在Bax 基因的低表達(dá)。Kra-jewski檢測(cè)了119 例乳腺癌，發(fā)現(xiàn)Bax 缺失率為34%，而正常的乳腺上皮細(xì)胞Bax 陽(yáng)性率為97%。Bax 表達(dá)與胃癌的關(guān)系研究不多，本研究結(jié)果顯示當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清使胃癌細(xì)胞中Bax 表達(dá)陽(yáng)性率為99. 7%，從而抑制Bcl-2 功能，加速細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起重要作用。PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，并在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起一定作用，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與PTEN 缺失和突變有關(guān)，各類癌的總突變率為5% ～ 40%。PTEN 基因突變可以降低瘤組織中脂質(zhì)磷酸酶活性，刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制凋亡。研究表明: PTEN 蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲程度密切相關(guān)。胃癌組織中PTEN 基因的檢測(cè)可了解與判斷腫瘤增生，侵襲及轉(zhuǎn)移的能力和程度。本實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清作用于胃癌細(xì)胞可以升高PTEN的表達(dá)量，從而抑制DNA 的復(fù)制; PTEN 升高，去磷酸化作用增強(qiáng)，從而抑制細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，抑制其轉(zhuǎn)移。
當(dāng)歸貝母苦參丸出自張仲景《金匱要略》。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，當(dāng)歸中多糖和阿魏酸可以抑制腫瘤增殖，是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或分化的天然誘導(dǎo)劑。貝母皂苷具有抗腫瘤作用。朱曉偉等研究表明: 苦參堿和氧化苦參堿作用人胃癌SGC-7901 細(xì)胞后，可增加G0 /G1期細(xì)胞所占百分比，降低S 期和G2 /M 期細(xì)胞百分比。李伏娥等證實(shí)苦參堿對(duì)人胃癌( SGC-7901) 細(xì)胞具有明顯抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制端粒酶活性。本方中當(dāng)歸為君藥，養(yǎng)血和血，行氣活血，補(bǔ)虛扶正，增強(qiáng)機(jī)體攻癌毒的能力補(bǔ)虛扶正; 貝母化痰散結(jié)，苦參清熱利濕解毒，共為臣藥; 當(dāng)歸貝母苦參丸作為抗腫瘤的方劑，為古方新用，針對(duì)腫瘤的病因病機(jī)特點(diǎn)，全方藥物切中腫瘤的病因病機(jī)，有活血補(bǔ)血，化痰散結(jié)，清熱解毒祛濕之效，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示當(dāng)歸貝母苦參丸通過(guò)對(duì)COX-2，Bax，PTEN 因子影響來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但關(guān)于當(dāng)歸貝母苦參丸抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
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