生物芯片技術(shù)論文(2)
生物芯片技術(shù)論文
生物芯片技術(shù)論文篇二
SNP芯片技術(shù)進(jìn)展
作者：董園園，盛海輝， 陳光，張春秀
【摘要】 SNP具有數(shù)量多、分布廣、易于快速檢測(cè)、便于分型等特點(diǎn)，其 分析 檢測(cè)技術(shù)的 發(fā)展 也引起了眾多 研究 人員的重視，不斷有新的檢測(cè) 方法 出現(xiàn)。RFLP技術(shù)、SBE技術(shù)、TaqMan技術(shù)、L-RCA技術(shù)等為SNP的檢測(cè)提供了快捷準(zhǔn)確的方法。由于SNP之間的關(guān)聯(lián)緊密復(fù)雜，因此需要一種有效的檢測(cè)方法，芯片檢測(cè)作為一種低成本、高通量的檢測(cè)方法已成為大規(guī)模SNP分析的有力檢測(cè)工具，將來(lái)可為遺傳學(xué)研究分析、個(gè)體化醫(yī)療的實(shí)施提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。
【關(guān)鍵詞】 單核苷酸多態(tài)性;芯片;分型;個(gè)體化醫(yī)療
【Abstract】 SNP is widely distributed in the human genome and it attracts the interest of many scientists. It can be detected much easier and faster. Several detection methods have been developed with high sensitivity in last years such as RFLP technology, single base extension method, TaqMan technology and L-RCA technology. Because of complicated relationship between SNP, it needs an effective detection. As an inexpensive and high throughput approach, microarray can give a guidance for personalized medicine in clinical and apply a diagnosis instrument for personalized treatment in the future.
【Key words】 polymorphism of mononucleotide; array; personalized treatment
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指存在于基因組特定位置上的單個(gè)核苷酸的變異，即由單個(gè)核苷酸置換、顛換、插入或缺失所形成的遺傳變異現(xiàn)象。在人類基因組中，已發(fā)現(xiàn)的SNP數(shù)量超過(guò)1000萬(wàn)，其分布密度在100～1000bp不等。SNP作為第三代遺傳診斷標(biāo)記，在疾病基因組學(xué)，藥物基因組學(xué)和群體進(jìn)化等 理論 研究中具有重大意義。SNP可直接 影響 個(gè)體間對(duì)疾病的易感性、外源物質(zhì)的代謝差異和藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)，因此對(duì)SNP的研究在個(gè)體化用藥、個(gè)體化 治療 中具有重要的指導(dǎo)作用。大規(guī)模SNP分型則需要準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法作為技術(shù)支持，而SNP芯片技術(shù)的研究與發(fā)展日后可成為分子診斷、臨床檢驗(yàn)、臨床治療、新藥開(kāi)發(fā)等方面的重要研究手段[1〗?
?1 SNP的檢測(cè)方法與技術(shù)
傳統(tǒng)SNP檢測(cè)方法包括DNA測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymor phism，RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性和變性梯度凝膠電泳等。這些技術(shù)必須通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且不能進(jìn)行多重分析，難以大規(guī)模開(kāi)展分析工作。新興的方法包括TaqMan探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。其中基因芯片技術(shù)具有高通量、簡(jiǎn)便快捷、平行化和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，且芯片技術(shù)的高密度探針矩陣可為大規(guī)模SNP分型提供一個(gè)高效檢測(cè)途徑。芯片技術(shù)平臺(tái)包括微球微點(diǎn)陣，纖維薄膜微點(diǎn)、玻璃片基微點(diǎn)陣芯片等，其探針密度跨越范圍幾百至上百萬(wàn)不等，其中GoldenGateTM[2〗?所使用的微球芯片密度可達(dá)100萬(wàn)，Affymetrix SNP芯片[3〗?密度近200萬(wàn)，可見(jiàn)芯片技術(shù)的探針密度可無(wú)限擴(kuò)增。而高通量的大規(guī)模SNPs篩選其瓶頸之處取決于DNA的制備方法與制備技術(shù)，而非雜交平臺(tái)的選擇。
2 SNP芯片技術(shù)
2.1 等位基因特異性延伸(allele-specific primer extension，ASPE) 此外Liu等人[4]在對(duì) 中國(guó) 人CYP3A基因多態(tài)性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)即采用了該設(shè)計(jì)方法完成了中國(guó)人CYP3A基因的多態(tài)性分型工作(這段增加點(diǎn) 內(nèi)容 ，RFLP不屬SNP芯片，在芯片上做延伸標(biāo)記，操作難， 文獻(xiàn) A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology)。
2.2 單堿基延伸(single base extension，SBE)技術(shù) 單堿基延伸技術(shù)是 目前 低密度芯片研發(fā)及制備DNA的主要技術(shù)。主要通過(guò)設(shè)計(jì)帶有雙重功能的SBE引物序列，該引物3’端為目的基因的互補(bǔ)序列，退火后在鏈3’端即SNP位點(diǎn)處延伸上帶有熒光信號(hào)標(biāo)記的單個(gè)堿基，5’端為與探針互補(bǔ)的標(biāo)簽序列。在目的基因指數(shù)擴(kuò)增步驟之后，單堿基延伸技術(shù)進(jìn)一步線性放大熒光信號(hào)并提高檢測(cè)靈敏度。該法可對(duì)隨機(jī)選取的SNP位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確特異的多重水平篩選[5,6〗?。Hirschhorn等[7〗?選取100多個(gè)SNP位點(diǎn)利用SBE方法進(jìn)行基因分型鑒別，其準(zhǔn)確度高達(dá)99%。類似反應(yīng)原理研制的SNP stream技術(shù)以PCR產(chǎn)物為模板，384孔板內(nèi)完成單堿基延伸標(biāo)記，其多重?cái)U(kuò)增規(guī)模達(dá)12重[8〗?。但是由于只加入2種不同類型熒光及一種等位基因延伸引物使得SNP stream每管反應(yīng)只能檢測(cè)1種突變類型，大大降低了SNP的突變類型選擇，限制了其在臨床上的 應(yīng)用 [9〗?。另外一種單堿基延伸技術(shù)是根據(jù)SNP突變類型設(shè)計(jì)2條SBE引物序列，3’末端堿基為SNP位點(diǎn)，延伸的堿基為SNP下游堿基[10〗?。根據(jù)匹配程度完成延伸標(biāo)記反應(yīng)并檢測(cè)等位基因具體類型。雙SBE引物的設(shè)計(jì)對(duì)比于SNP stream技術(shù)來(lái)說(shuō)只需要一種熒光類型，不存在限制SNPs突變類型檢測(cè)的 問(wèn)題 。
2.3 TagMan探針及芯片 TagMan探針是定量檢測(cè)靶DNA的一種方法，5’末端攜有熒光標(biāo)記物，3’端標(biāo)有熒光淬滅集團(tuán)，利用Tag聚合酶的外切活性，并伴隨熒光共振能量轉(zhuǎn)移恢復(fù)染料的熒光活性，堿基序列間的不完全匹配則導(dǎo)致所釋放熒光強(qiáng)度的差異進(jìn)而用來(lái)鑒別基因多態(tài)性差異。將實(shí)時(shí)檢測(cè)與芯片技術(shù)融合的TagMan芯片，其探針3’端經(jīng)氨基修飾后依靠共價(jià)鍵結(jié)合于芯片表面，探針中間序列攜帶熒光集團(tuán)，依賴堿基序列間的物理距離而使中間序列的熒光集團(tuán)完成靶DNA遺傳信息的實(shí)時(shí)分析工作[11〗?。TagMan芯片既融合了常規(guī)TagMan技術(shù)定量檢測(cè)，靈敏度及實(shí)時(shí)檢測(cè)功能，也兼?zhèn)湫酒钠叫谢咄糠治鲞@一特點(diǎn)。由于PCR擴(kuò)增與TagMan探針酶切同步進(jìn)行，隨著多重水平的增加，必然導(dǎo)致非特異性信號(hào)增多，該技術(shù)是否適用于中低密度的SNP芯片，尚有待于進(jìn)一步研究。
2.4 基于連接的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(ligation-rolling circle ampification，L-RCA) T4連接酶或熱穩(wěn)定連接酶介導(dǎo)的掛鎖探針環(huán)化方法可靈敏及特異的鑒別靶DNA序列的點(diǎn)突變。L-RCA技術(shù)掛鎖探針的5’及3’端序列同靶DNA的SNP位點(diǎn)上游及下游序列分別互補(bǔ)，3’端延伸一個(gè)堿基后，連接酶作用下可成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。探針序列中間攜有通用序列、標(biāo)簽序列及酶切位點(diǎn)[12〗?。環(huán)狀探針序列經(jīng)滾環(huán)擴(kuò)增后再做酶切處理即可做雜交判別。Baner等[13〗?采用該技術(shù)檢測(cè)干豆?fàn)詈俗冃圆∪说?3個(gè)SNP位點(diǎn)突變同疾病相關(guān)性試驗(yàn)中，設(shè)計(jì)13條探針檢測(cè)位點(diǎn)突變類型。 L-RCA的設(shè)計(jì)及基因序列的復(fù)雜程度等導(dǎo)致通量不高，不能滿足高通量的芯片分型需要。
2.5 分子倒置探針 分子倒置探針(Molecular Inversion Probe，MIP)同線性探針序列相比能夠指數(shù)級(jí)減少由于線性引物序列所引起的交叉反應(yīng)及二聚體現(xiàn)象，具備了分子掛鎖探針的優(yōu)點(diǎn)。MIP探針序列由7部分序列組成：2個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，可利用限制性內(nèi)切酶(HindⅢ，BamHⅠ，EcoRⅠ，EcoRV，XbaⅠ)處理探針序列，2段目的基因互補(bǔ)序列(填補(bǔ)SNP位點(diǎn)兩端序列并控制序列特異性)、2段通用引物序列以及1段特異性標(biāo)簽序列。探針序列同目的基因組結(jié)合后成環(huán)狀，MIP探針3’端獲得一個(gè)堿基并延伸后在連接酶作用下與5’序列連接成環(huán)，該延伸位點(diǎn)即為SNP檢測(cè)位點(diǎn)。由于內(nèi)切酶I的作用而發(fā)生序列倒置重組。通用引物作用下完成信號(hào)擴(kuò)增，內(nèi)切酶Ⅰ處理后獲得Taq標(biāo)簽序列。該反應(yīng)在同一體系中可完成1萬(wàn)多重的SNP檢測(cè)通量[14〗??巖雜τ糜赟NP定制。另一方面，盡管標(biāo)簽(tag)SNP較少，數(shù)量眾多的SNP可在一定程度上彌補(bǔ)此不足。
2.7 基于連接ASPE技術(shù) GoldenGateTM技術(shù)是目前定制SNP芯片技術(shù)中通量最高的，可達(dá)100萬(wàn)，但對(duì)基因組需要量只需要250ng。其原理是每個(gè)SNP設(shè)計(jì)2條等位基因特異性引物(ASO)和1條位點(diǎn)特異性引物 (LSO)，均攜有不同的通用引物序列。LSO位于SNP下游10～20bp處，從而能夠有效避開(kāi)重復(fù)序列以及回文序列，保證了反應(yīng)特異性。利用聚合酶填補(bǔ)ASO及LSO間空隙，并由連接酶封閉缺口。以所得產(chǎn)物為模板，3條通用引物(其中2條與ASO互補(bǔ)的通用引物標(biāo)記有不同的熒光素)即完成擴(kuò)增及雜交反應(yīng)。該技術(shù)的多重檢測(cè)水平可極大的滿足基因分型的檢測(cè)需要，基因分型準(zhǔn)確率可達(dá)96.64%。但是該技術(shù)只適用于二態(tài)變化的SNP檢測(cè)，所能檢測(cè)的SNP大約只有60%[2,15〗?。對(duì)于全基因組掃描，該技術(shù)的芯片產(chǎn)品所檢測(cè)的是標(biāo)簽SNP，遺傳信息含量豐富。此外，Macgregor等研究顯示，在應(yīng)用DNA Pool進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究， GoldenGateTM比Affymetrix SNP芯片更為有效(Highly cost-efficient genome-wide association studies using DNA pools and dense SNP arrays. Stuart Macgregor1,*, Zhen Zhen Zhao2, Anjali Henders2, Martin G. Nicholas1, Grant W. Montgomery2 and Peter M. Visscher1)。
3 前景與展望
隨著芯片技術(shù)的 發(fā)展 ，對(duì)于原核生物等類似簡(jiǎn)單的基因組序列，其基因組DNA可以直接 應(yīng)用 芯片技術(shù)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。面對(duì)高度復(fù)雜的人類基因組，從約30億堿基對(duì)中鑒別分型單個(gè)堿基的變化無(wú)疑是一件浩瀚的工程。針對(duì)大規(guī)模基因組內(nèi)遺傳學(xué)SNPs的篩查以及小規(guī)模的個(gè)體藥物檢測(cè)與臨床應(yīng)用檢測(cè)芯片的需求，現(xiàn)有SNP芯片技術(shù)的瓶頸依舊是基因組的處理與制備。隨著基因體外擴(kuò)增技術(shù)與信號(hào)級(jí)聯(lián)放大技術(shù)的發(fā)展，雖解決了有限的樣本基因組 問(wèn)題 ，但是由于擴(kuò)增反應(yīng)在設(shè)計(jì)上的束縛以及反應(yīng)復(fù)雜性等因素，現(xiàn)存的主要問(wèn)題是如何完全及高效地獲得個(gè)體SNPs信息。這也是將來(lái)芯片技術(shù)所需解決的一個(gè)問(wèn)題。
SNP芯片的開(kāi)發(fā)及在基因多態(tài)性 研究 上不但提高了個(gè)體化醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)的水平，也為日后個(gè)體化藥物的使用提供診斷依據(jù)，促進(jìn)小規(guī)模診斷市場(chǎng)的開(kāi)發(fā)與完善。SNP芯片的研究有能力成為個(gè)體化醫(yī)療的技術(shù)保障，隨著SNP芯片檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)藥物代謝基因所研制的中低密度遺型傳學(xué)檢測(cè)芯片，其低成本、高通量、平行化的檢測(cè)特點(diǎn)適應(yīng)了個(gè)體化用藥檢測(cè)的需求，將來(lái)可在個(gè)體藥代研究、個(gè)體化醫(yī)療以及個(gè)體用藥指導(dǎo)等各方面的醫(yī)療檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用[16〗?。?
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