納米生物技術(shù)論文

　　納米是單個(gè)細(xì)菌用肉眼是根本看不到的，用顯微鏡測(cè)直徑大約是五微米。下面小編給大家分享一些納米生物技術(shù)論文，大家快來跟小編一起欣賞吧。

　　納米生物技術(shù)論文篇一

　　金納米顆?？梢暬瘋鞲衅髟谏锓肿臃治鲋械难芯窟M(jìn)展

　　摘 要 基于金納米顆粒的可視化傳感器具有靈敏度高、選擇性好、肉眼可見、無需大型儀器等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有應(yīng)用潛力的分析檢測(cè)方法。生物分子分析檢測(cè)與人體健康息息相關(guān)。本文綜述了近幾年基于金納米顆粒的可視化傳感器在生物分子分析中的應(yīng)用研究。

　　關(guān)鍵詞 金納米顆粒; 可視化傳感器; 生物分子; 評(píng)述

　　1 引 言

　　金納米顆粒具有非常高的消光系數(shù)(如13 nm金納米顆粒的消光系數(shù)高達(dá)2.7×108 mol/(L・cm)，比一般的染料分子高1000倍以上，根據(jù)Beer Lambert定律可知，金納米顆粒所能達(dá)到的檢測(cè)限遠(yuǎn)低于染料分子[1]。除了金鈉米顆粒外，由于金納米顆粒體系在不同狀態(tài)下會(huì)有不同的顏色變化，因此金納米顆粒在可視化檢測(cè)中占有重要的地位。基于金納米顆粒的可視化檢測(cè)機(jī)理是：單分散金納米顆粒在溶液中呈現(xiàn)紅色，當(dāng)加入被檢測(cè)物時(shí)，金納米顆粒發(fā)生聚集，從而使顆粒間的等離子體耦合發(fā)生改變，吸收峰發(fā)生紅移，溶液的顏色由紅色變?yōu)樽仙蛩{(lán)色[2，3]。金納米顆粒除了具有上述的光學(xué)特性外，其表面易于進(jìn)行化學(xué)修飾也為金納米顆粒在分析檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用提供了便捷條件。例如金納米顆粒表面可以通過修飾小分子、蛋白質(zhì)、多肽、DNA等實(shí)現(xiàn)對(duì)不同靶標(biāo)物質(zhì)的特異性檢測(cè)，包括小分子、重金屬離子、蛋白質(zhì)、核酸、腫瘤細(xì)胞和病原體等?；诮鸺{米顆粒的可視化檢測(cè)方法不依賴任何大型儀器，溶液顏色變化即可作為讀出信號(hào)，信號(hào)檢出速度較快，所需材料成本較為低廉，尤其適用于有快速檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求和條件相對(duì)落后不具備大型儀器的區(qū)域。

　　2 基于金納米顆粒的生物小分子分析檢測(cè)體系

　　2.1 三磷酸腺苷(ATP)檢測(cè)

　　三磷酸腺苷(ATP)是體內(nèi)的儲(chǔ)能載體，在許多生理和病理過程中起著重要的作用，如當(dāng)細(xì)胞凋亡或壞死誘導(dǎo)的線粒體破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ATP含量會(huì)降低，因此快速檢測(cè)體內(nèi)的ATP含量是非常重要的[4]?；谖葱揎椊鸺{米顆粒和ATP的適配體可構(gòu)建高靈敏度的傳感器用于檢測(cè)ATP[5]。改進(jìn)后的方法還可以用于檢測(cè)可卡因[6]。利用ATP誘導(dǎo)的金納米顆粒組裝體分散的原理可以構(gòu)建一種可視化檢測(cè)ATP的通用新方法，這個(gè)傳感器主要包含3部分，兩種DNA修飾的金納米顆粒和一個(gè)可以識(shí)別ATP并且可以與這兩種DNA配對(duì)的DNA，它們由于可以相互配對(duì)而使金納米顆粒聚集，金納米顆粒溶液的顏色就會(huì)從紅色變?yōu)樽仙?。?dāng)加入ATP時(shí)，由于ATP與其適配體具有很強(qiáng)的作用，這樣ATP就會(huì)使金納米顆粒組裝體解散而使金納米顆粒分散，從而達(dá)到可視化檢測(cè)ATP的目的[7]。近期，利用適配體和包有SiO2的星形金納米顆粒，結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)(SERS)可以實(shí)現(xiàn)ATP的超靈敏的定量檢測(cè)，檢出限為12.4 pmol/L[8]。以上基于金納米顆粒的ATP可視化檢測(cè)方法均可以達(dá)到高選擇性檢測(cè)ATP的目的，這些方法具有操作簡便，價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，但是距實(shí)際應(yīng)用還有一定的差距，這些方法還不能應(yīng)用在復(fù)雜的實(shí)際樣品中的ATP的檢測(cè)，還需要深入研究以改善其實(shí)用性。

　　2.2 多巴胺檢測(cè)

　　多巴胺是一種最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它在一些大腦功能上起了非常重要的作用。多巴胺含量的異?？赡芘c一些疾病有關(guān)，如帕金森癥、精神異常等[9]。因此快速簡便的高靈敏度的檢測(cè)多巴胺的方法是非常有應(yīng)用前景的。利用4 巰基苯硼酸和二巰基丙酸馬來酸酯修飾金納米顆粒表面，由于多巴胺分子一端的胺基可以與馬來酸酯反應(yīng)，另一端的鄰苯二酚與硼酸反應(yīng)，多巴胺的加入使金納米顆粒聚集，基于此原理，這種方法的檢測(cè)限可以達(dá)到0.5 nmol/L，并且這種方法可以用在小鼠腦脊液中的多巴胺的檢測(cè)(圖1)[10]。利用二巰基丙酸馬來酸酯修飾的金納米顆粒和Fe3+為交聯(lián)劑發(fā)展了一種可視化檢測(cè)多巴胺的方法，利用多巴胺通過胺基與修飾在金納米顆粒表面的丙酸馬來酸酯反應(yīng)，使多巴胺就修飾在了金納米顆粒的表面，F(xiàn)e3+會(huì)與鄰苯二酚結(jié)合而使金納米顆粒聚集[11]。研究發(fā)現(xiàn)， 多巴胺可以增強(qiáng)牛血清蛋白質(zhì)修飾的熒光金團(tuán)簇的電致化學(xué)發(fā)光，利用這個(gè)性質(zhì)可以選擇性地檢測(cè)多巴胺[12]。由于多巴胺分子上的鄰苯二酚與銀納米顆粒具有很強(qiáng)的相互作用，多巴胺加入會(huì)使銀納米顆粒聚集，根據(jù)這種現(xiàn)象可以構(gòu)建一種可視化檢測(cè)多巴胺的方法，這種方法具有很好的選擇性，尿酸、抗壞血酸、葡萄糖等均不干擾多巴胺的檢測(cè)。此外， 這種方法還具有很高的靈敏度，其檢出限可以達(dá)到60 nmol/L[13]?；陔娀瘜W(xué)的方法，利用金納米顆粒和分子印跡高分子也可實(shí)現(xiàn)對(duì)多巴胺的檢測(cè)，檢出限可達(dá)到7.8 nmol/L[14]。這些多巴胺的檢測(cè)結(jié)果具有較低的檢出限，但仍不能滿足對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)需求，因此發(fā)展原位的、可靠性更高的多巴胺的可視化檢測(cè)新方法仍然十分緊迫。

　　2.3 葡萄糖檢測(cè)

　　葡萄糖是生物體最基本的物質(zhì)和生物過程中普遍存在的能量供給物，但是許多研究表明， 腎性糖尿、囊性纖維化病、糖尿病等都與葡萄糖輸送障礙有關(guān)[15]。因此葡萄糖的快速準(zhǔn)確檢測(cè)是非常重要的。目前有許多基于金納米顆?？梢暬瘷z測(cè)葡萄糖的方法。采用碳化二亞胺，將葡萄糖氧化酶修飾在金納米顆粒的表面，加入葡萄糖，使金納米顆粒聚集，當(dāng)葡萄糖的含量大于100 mg/L時(shí)，金納米顆粒溶液的顏色變?yōu)樗{(lán)色[16]。利用金納米顆粒的光學(xué)性質(zhì)和串聯(lián)反應(yīng)，可以構(gòu)建一種快速簡便可視化檢測(cè)腦脊液中葡萄糖的方法[17]。基于過氧化氫引起的溶膠 凝膠轉(zhuǎn)變過程，可以構(gòu)建一種可視化檢測(cè)葡萄糖的新方法[18]?；趥鹘y(tǒng)的銀鏡反應(yīng)和納米材料優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，發(fā)展了一種可視化檢測(cè)還原性糖(葡萄糖)的方法(圖2a)[19]。采用粒徑13 nm的球形金納米顆粒作為銀鏡反應(yīng)的信號(hào)放大介質(zhì)，由于金納米顆粒的存在，銀鏡反應(yīng)所生成的單質(zhì)銀會(huì)沉積在納米金上，形成一種類似金核銀殼的結(jié)構(gòu)。反應(yīng)后溶液顏色的變化與溶液中葡萄糖的濃度相關(guān)，可用于葡萄糖的定性及定量分析，其檢測(cè)范圍是40～1000 μmol/L。在此工作基礎(chǔ)上，本研究組利用表面帶負(fù)電荷的棒狀金納米顆粒的富集作用和銀納米顆粒的特征表面等離子體共振吸收峰，發(fā)展了一種靈敏度較高的用于葡萄糖可視化檢測(cè)方法(圖2b)[20]。在電荷相互作用下，表面帶負(fù)電荷的金納米棒會(huì)吸附大量銀離子從而增加其局部濃度，當(dāng)葡萄糖存在時(shí)會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成大量的銀納米顆粒。我們還研究了材料表面的電荷性質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響，發(fā)現(xiàn)只有表面帶有負(fù)電荷的納米金材料才能通過電荷相互作用促使反應(yīng)的發(fā)生。值得注意的是，該體系中金納米棒溶液濃度極低，不存在葡萄糖時(shí)溶液呈無色，加入葡萄糖后溶液會(huì)呈現(xiàn)銀納米顆粒的亮黃色。該方法的檢測(cè)范圍是0.07～4 μmol/L，已成功用于人血漿中葡萄糖的測(cè)定。這些葡萄糖的可視化檢測(cè)方法大部分仍然停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，檢測(cè)結(jié)果的可靠性尤其在定量檢測(cè)方面仍需要大量的實(shí)際樣品來驗(yàn)證。 　　2.4 尿酸檢測(cè)

　　尿酸是人體內(nèi)嘌呤核苷酸的代謝物，血清中高含量尿酸會(huì)引起痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等疾病，并且尿酸含量的異常會(huì)引起心血管、神經(jīng)、腎等相關(guān)的疾病[21，22]。因此人體內(nèi)尿酸的檢測(cè)是非常重要的。由于目前許多臨床上檢測(cè)尿酸方法都采用酶和一些特殊的試劑，所以發(fā)展簡便、價(jià)廉、快速檢測(cè)尿酸的新方法是非常必要的。Bera等[23]利用2 硫尿嘧啶修飾的金納米顆?？梢詷?gòu)建一種可視化檢測(cè)血清中尿酸的方法，該方法的檢出限為0.5 μmol/L。多巴胺、抗壞血酸、葡萄糖等一些生物相關(guān)的物質(zhì)對(duì)尿酸的檢出無明顯干擾。此方法不依賴于復(fù)雜的儀器操作和昂貴的試劑，檢測(cè)方法簡便，有望應(yīng)用在實(shí)際樣品的檢測(cè)。結(jié)合包有Fe3O4的金納米顆粒和石墨烯，利用電化學(xué)的方法，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗壞血酸、尿酸、醋氨酚和多巴胺的檢測(cè)，顯然該方法對(duì)尿酸的特異性檢測(cè)能力不強(qiáng)[24]。

　　2.5 生物硫醇分子檢測(cè)

　　低分子量生物巰基化合物在生命過程中起著重要作用，簡便快速檢測(cè)生物巰基化合物是十分必要的。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，在復(fù)雜的環(huán)境中能夠穩(wěn)定金納米顆粒。谷胱甘肽可以使金納米顆粒與一種水溶性共聚物組裝體分散，根據(jù)這個(gè)現(xiàn)象可以發(fā)展一種可視化檢測(cè)谷胱甘肽的方法[25]。利用谷胱甘肽阻止金納米顆粒聚集能夠發(fā)展一種快速簡便在線選擇性檢測(cè)谷胱甘肽的方法，而半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽二硫化物都不干擾谷胱甘肽的檢測(cè)，該方法的線性范圍是8～250 nmol/L[26]。利用含氟表面活性劑修飾的金納米顆粒 (Fluorosurfactant capped gold nanoparticles，F(xiàn)SN AuNPs) 可以實(shí)現(xiàn)半胱氨酸和同型半胱氨酸的可視化檢測(cè)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸以離子對(duì)的形式與半胱氨酸作用可以誘導(dǎo)金納米顆粒聚集，這種原理可以用于檢測(cè)半胱氨酸，并且其它氨基酸和小鼠腦中常見的乳酸、葡萄糖等都不干擾半胱氨酸的檢測(cè)，半胱氨酸的濃度可以直接通過金納米顆粒的顏色觀測(cè)，其線性范圍是0.166～1.67 μmol/L，檢出限為100 nmol/L。這種方法已成功應(yīng)用在小鼠腦中的半胱氨酸的檢測(cè)[28]?；贖g2+可以淬滅熒光金納米顆粒的熒光，同時(shí)Hg2+又與生物硫醇有較強(qiáng)的結(jié)合作用，能夠使被淬滅的熒光恢復(fù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物硫醇分子的檢測(cè)[29]。但該方法不能區(qū)分出半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽。

　　2.6 氨基酸檢測(cè)

　　金納米顆粒還可以用于其它氨基酸的可視化檢測(cè)，利用N 乙酰基半胱氨酸修飾的金納米顆?？梢詫?shí)現(xiàn)對(duì)手性酪氨酸的檢測(cè)和分離手性酪氨酸。L 酪氨酸可以與金納米顆粒表面的N 乙?；腚装彼嵝纬蓺滏I而使金納米顆粒聚集，但是，D 酪氨酸不能與N 乙酰基半胱氨酸形成氫鍵而不能使金納米顆粒聚集，這樣就可以選擇性地檢測(cè)L酪氨酸，通過離心可以從溶液中分離出兩種手性氨基酸[30]。由于賴氨酸在pH 3.0時(shí)可以使檸檬酸根穩(wěn)定的金納米顆粒聚集，其它氨基酸卻不能誘導(dǎo)金納米顆粒聚集，根據(jù)該原理發(fā)展了一種基于金納米顆粒的可視化檢測(cè)賴氨酸的方法，其線性范圍是1～70 μmol/L，檢出限是0.8 μmol/L [31]。結(jié)合金納米顆粒、適配體，利用電化學(xué)的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)組氨酸的超靈敏檢測(cè)[32]。這些方法在實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步探討。

　　3 基于金納米顆粒的生物大分子分析檢測(cè)體系

　　生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)的檢測(cè)對(duì)疾病的診斷具有重要的指導(dǎo)作用。檢測(cè)這些物質(zhì)的方法通常需要復(fù)雜的分離、純化步驟，昂貴且大型的儀器及技術(shù)性人員操作，限制了這些方法的推廣使用。金納米顆?？梢暬瘷z測(cè)不依賴任何大型儀器的優(yōu)點(diǎn)為生物大分子的檢測(cè)分析帶來了新策略。核酸檢測(cè)通常采用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain Reaction，PCR) 復(fù)雜耗時(shí)，對(duì)環(huán)境潔凈度要求高，易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果;如果采用金納米顆?？梢暬瘷z測(cè)所需時(shí)間較短、操作簡單，可以用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，能夠在一定程度上解決傳統(tǒng)PCR方法存在的問題。蛋白質(zhì)檢測(cè)中傳統(tǒng)的免疫檢測(cè)方法所需時(shí)間長、步驟多，利用金納米顆粒溶液或者是金標(biāo)試紙條的方法操作簡單，能夠?qū)崿F(xiàn)快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

　　3.1 核酸檢測(cè)

　　核酸分子的特異性檢測(cè)是生物分析中的一個(gè)重要方面，在癌癥的早期檢測(cè)、遺傳性基因疾病的臨床診斷以及病原體準(zhǔn)確鑒別等臨床實(shí)踐方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值[33]。PCR是傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法，但其所需的熱擴(kuò)增儀器和反應(yīng)試劑昂貴，樣品準(zhǔn)備工作繁瑣、反應(yīng)所需時(shí)間長， 且不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，這些亟待解決的問題恰恰給利用金納米顆粒做核酸檢測(cè)提供了契機(jī)。1996年，Mirkin等[34]首次發(fā)現(xiàn)DNA分子可以影響金納米顆粒的組裝行為，隨后他們將DNA通過巰基修飾到金納米顆粒上構(gòu)建了基于金納米顆粒的核酸檢測(cè)傳感器[35]。從此利用金納米顆?？梢暬瘷z測(cè)核酸的研究就引起了廣泛關(guān)注。

　　利用單鏈DNA，未修飾金納米顆粒和帶正電的水溶性好的共軛聚合物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA、蛋白質(zhì)、小分子和離子的檢測(cè)[36]。設(shè)計(jì)該DNA傳感器主要基于作者觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：(1)在較低的鹽濃度下，無論單鏈DNA， 還是雙鏈DNA， 都能較好地保護(hù)金納米顆粒，使其維持分散狀態(tài)不聚沉;(2)共軛聚合物的加入能夠?qū)е律鲜龅慕鸺{米顆粒聚沉;(3)在一定的環(huán)境條件下，相比于雙鏈DNA和折疊DNA，共軛聚合物更容易與單鏈DNA結(jié)合。因此當(dāng)體系中只有單鏈DNA保護(hù)金納米顆粒時(shí)，加入共軛聚合物會(huì)使原本保護(hù)在金納米顆粒表面的單鏈DNA脫離，從而導(dǎo)致金納米顆粒的聚沉，溶液顏色由紅變藍(lán);而當(dāng)體系中存在被檢測(cè)DNA，它與金納米顆粒表面的探針DNA互補(bǔ)配對(duì)，配對(duì)后的DNA雙鏈與共軛聚合物作用較弱，不會(huì)導(dǎo)致金納米顆粒沒有保護(hù)物而聚沉，溶液顏色不發(fā)生變化(圖3)。該方法的創(chuàng)新之處在于應(yīng)用簡單的DNA互補(bǔ)配對(duì)原理，同時(shí)利用共軛聚合物對(duì)不同狀態(tài)的DNA的結(jié)合力不同，通過對(duì)金納米顆粒聚集狀態(tài)的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA的特異性檢測(cè)。 　　應(yīng)用金納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)核酸鏈中單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)。單核苷酸多態(tài)性是遺傳變異中最普遍的類型，許多單核苷酸多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)與一些藥物反應(yīng)和各種疾病有著直接關(guān)系。因此單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法的發(fā)展對(duì)于疾病的診斷和治療有著重要意義。單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)是所有利用堿基互補(bǔ)配對(duì)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的基礎(chǔ)。隨著近些年納米技術(shù)的發(fā)展，利用金納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)。1997年， Mirkin等[35]報(bào)道的工作中除了對(duì)單鏈DNA的檢測(cè)，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了對(duì)單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)。近幾年利用金納米顆粒實(shí)現(xiàn)單堿基錯(cuò)配檢測(cè)的研究多集中在如何提高檢測(cè)體系的靈敏度和特異性，其中最常用的手段是結(jié)合酶促反應(yīng)。將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、限制性內(nèi)切酶酶解作用和金納米顆粒聚集導(dǎo)致顏色變化的性質(zhì)結(jié)合在一起，可以發(fā)展一種可視化的單核苷酸多態(tài)性基因分型的方法[37]。該方法由于聚合酶Phi29高效的擴(kuò)增效率，體系的檢測(cè)靈敏度很高。但反應(yīng)體系中需要使用3種不同的酶，較為復(fù)雜，成本也相對(duì)較高。利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和金納米顆粒也可以直接實(shí)現(xiàn)DNA的檢測(cè)[38]。集合核酸酶和無標(biāo)記的金納米顆粒也可以構(gòu)建一種檢測(cè)核酸鏈中單堿基錯(cuò)配的方法[39]。該體系利用在相同的堿基組成和濃度下，單磷酸鹽比單鏈DNA和雙鏈DNA能夠更好地穩(wěn)定未修飾的金納米顆粒的性質(zhì)，選擇應(yīng)用的核酸酶具有優(yōu)越的堿基錯(cuò)配識(shí)別能力，當(dāng)加入的目標(biāo)物與探針完全匹配時(shí)，核酸酶不發(fā)生作用;但當(dāng)加入的目標(biāo)物與探針即使有一個(gè)堿基錯(cuò)配，核酸酶也能將其識(shí)別并水解產(chǎn)生單磷酸根。當(dāng)體系中有單磷酸根存在，加入的未修飾的金納米顆粒在較高的鹽濃度下能夠穩(wěn)定存在，溶液顏色保持紅色。若體系中未能產(chǎn)生單磷酸根，加入未修飾的金納米顆粒后在較高的鹽濃度下金納米顆粒會(huì)發(fā)生聚沉，溶液顏色發(fā)生變化。此方法應(yīng)用于乙型肝炎病毒 (HBV) 基因單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)，但由于該檢測(cè)體系中未涉及被檢測(cè)物的擴(kuò)增反應(yīng)，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中需要做傳統(tǒng)的PCR和一些分離純化步驟，所以整個(gè)檢測(cè)分析過程仍較為復(fù)雜。通過巧妙設(shè)計(jì)發(fā)卡形DNA結(jié)合膠體金試紙條技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)可視化單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)，并在一個(gè)試紙條上實(shí)現(xiàn)兩個(gè)堿基錯(cuò)配點(diǎn)的檢測(cè)[40]。由于試紙條便攜易操作的優(yōu)點(diǎn)使得該方法為即時(shí)診斷提供可能，但這種方法的靈敏度還有待進(jìn)一步提高。結(jié)合電化學(xué)方法和金納米顆粒，一些超靈敏的核酸檢測(cè)的方法逐步被發(fā)展，一些方法的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到飛摩爾級(jí)別甚至更低[41～43]。

　　利用DNA修飾的金納米顆粒構(gòu)建的傳感器首先需要實(shí)現(xiàn)DNA對(duì)金納米顆粒的修飾，這個(gè)步驟所需時(shí)間較長，需要1～2 d，如果這個(gè)過程簡化，將更有利于該傳感器的構(gòu)建。Liu等[44，45]在一定程度上縮短了修飾時(shí)間。在DNA檢測(cè)過程中省去PCR過程，實(shí)現(xiàn)金納米顆粒實(shí)現(xiàn)高度靈敏可視化檢測(cè)DNA還需要進(jìn)一步的探索研究工作。

　　3.2 蛋白質(zhì)檢測(cè)

　　蛋白質(zhì)檢測(cè)在臨床疾病診斷中具有重要意義，例如血清白蛋白測(cè)定能夠反應(yīng)肝臟的損傷程度，尿微量白蛋白的測(cè)定能夠反應(yīng)腎臟是否健康，甲胎蛋白的檢測(cè)是診斷原發(fā)性肝癌的重要手段等。人們最為熟悉的應(yīng)用膠體金法檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法如早早孕試紙條，通過膠體金試紙條可視化檢測(cè)尿中絨毛膜促性腺激素 (HCG) 是否存在，實(shí)現(xiàn)快速判斷是否懷孕。利用膠體金技術(shù)，市場(chǎng)上還有檢測(cè)血吸蟲的試紙條，檢測(cè)風(fēng)疹的試紙條等。由于很多蛋白質(zhì)的檢測(cè)還不能夠簡單靈敏地實(shí)現(xiàn)，近幾年人們?nèi)圆粩嗵剿骼眉{米材料(如金納米顆粒)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)。

　　利用金納米顆粒的光電性質(zhì)， 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)分析。結(jié)合金納米顆粒能夠淬滅熒光分子的熒光這一性質(zhì)可以設(shè)計(jì)一種新型的蛋白質(zhì)檢測(cè)傳感器[46]。首先，利用熒光標(biāo)記的抗原在體系中形成金納米顆粒 抗原結(jié)合片段 熒光標(biāo)記抗原的檢測(cè)體系，此時(shí)熒光處于淬滅狀態(tài);當(dāng)溶液中存在游離的未被熒光標(biāo)記的抗原時(shí)，其會(huì)與抗原結(jié)合片段上結(jié)合的熒光標(biāo)記抗原發(fā)生競(jìng)爭取代作用，部分熒光標(biāo)記抗原從金納米顆粒表面脫離下來回到溶液中，使溶液熒光信號(hào)增強(qiáng)，通過檢測(cè)溶液中熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原的檢測(cè)。本研究組通過制備羅丹明B功能化金納米顆粒，建立了高靈敏度， 熒光、顏色雙讀出信號(hào)的生物傳感器，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠腦脊液中乙酰膽堿酯酶的活性(圖4)[47]。乙酰膽堿酯酶能水解其底物硫代乙酰膽堿，生成硫代膽堿。硫代膽堿通過其巰基與納米金結(jié)合，將金納米顆粒表面的羅丹明B取代下來，羅丹明B的熒光恢復(fù)。同時(shí)，硫代膽堿末端的季銨鹽基團(tuán)與金納米顆粒表面殘留羅丹明B的羧基通過靜電相互作用，導(dǎo)致金納米顆粒聚集，使溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色(或紫色)。通過羅丹明B的熒光恢復(fù)和溶液顏色變化，便可測(cè)量溶液中乙酰膽堿酯酶的水平。為了驗(yàn)證這種檢測(cè)方法在復(fù)雜樣品中的可適用性，檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)基因小鼠腦脊液中乙酰膽堿酯酶的水平，該方法在復(fù)雜樣品中依然保持較高的靈敏度和特異性。

　　圖4 基于羅丹明B 金納米顆粒檢測(cè)(通過顏色變化和熒光)乙酰膽堿酯酶的設(shè)計(jì)策略[47]

　　Fig.4 Design of the detection (colorimetric and fluorometric) of acetylcholin esterase (AChE) based on rhodamine B gold nanoparticles[47]

　　此外，本研究組還發(fā)展了一種通過檢測(cè)Cu2+間接檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的方法[48]。將二抗進(jìn)行氧化銅納米顆粒標(biāo)記，在免疫反應(yīng)結(jié)束后使用稀酸將氧化銅納米顆粒溶解， 釋放出Cu2+， Cu2+經(jīng)抗壞血酸欠還原后作為Click反應(yīng)的催化劑，促進(jìn)炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒直接的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致納米顆粒由穩(wěn)定的分散狀態(tài)到聚集狀態(tài)，溶液顏色由紅變藍(lán)(圖5)。此方法成功檢測(cè)了HIV病毒感染病人血清中的HIV抗體。這種方法提供了一種新的信號(hào)擴(kuò)增方式，通過高靈敏度的檢測(cè)金屬離子間接檢測(cè)生物大分子。同時(shí)，提出了可視化方法，無需大型復(fù)雜儀器，為便攜快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供新策略。蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下可將Cu2+還原為Cu+，利用Click配體修飾的金納米顆粒檢測(cè)Cu+能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的間接檢測(cè)[49]。利用該方法檢測(cè)牛血清白蛋白 (BSA)，線性范圍為30～2500 mg/L。 　　圖5 基于CuO納米顆粒標(biāo)記的抗體和Click反應(yīng)的免疫檢測(cè)方法示意圖[48]

　　Fig.5 Immunoassay based on CuO labeled antibody and click Chemistry[48]

　　通過調(diào)節(jié)金納米顆粒的尺寸也可以使溶液呈現(xiàn)不同的顏色。利用過氧化氫酶標(biāo)記的二抗，結(jié)合免疫檢測(cè)的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的超靈敏檢測(cè)[50]。該體系的原理是過氧化氫還原Au3+生成金納米顆粒，當(dāng)有被檢測(cè)蛋白質(zhì)存在時(shí)，就會(huì)結(jié)合過氧化氫酶標(biāo)記的二抗，過氧化氫酶消耗過氧化氫，過氧化氫濃度降低導(dǎo)致金納米顆粒的生成動(dòng)力學(xué)減慢，生成的金納米顆粒聚集，溶液顏色為紫色;反之生成分散較好的金納米顆粒，溶液顏色為紅色。該方法檢出限可達(dá)到10

　　Symbolm@@ 18 g/mL，并且肉眼可見溶液顏色的變化。該方法基于免疫檢測(cè)中抗原抗體的識(shí)別作用，對(duì)被檢測(cè)蛋白具有較好的選擇性。利用凝血酶和纖維蛋白原之間特殊的識(shí)別作用和金納米顆粒尺寸變化會(huì)引起溶液顏色變化的現(xiàn)象可以構(gòu)建超靈敏的凝血酶可視化檢測(cè)體系[51]。首先將微孔板和金納米顆粒表面用纖維蛋白原修飾，然后向修飾的微孔板里加入修飾的金納米顆粒和凝血酶，通過凝血酶與纖維蛋白的相互作用，將金納米顆粒固定在微孔板表面，再加入氯金酸(HAuCl4) 羥胺(NH2OH)溶液，金納米顆粒能夠催化NH2OH還原Au3+形成更大的金納米顆粒，使溶液呈現(xiàn)不同的顏色。該體系的檢出限為3.2 fmol/L， 其它蛋白對(duì)凝血酶的可視化檢測(cè)無干擾。這兩個(gè)方法靈敏度高，選擇性好， 在實(shí)際樣品分析中具有應(yīng)用潛力。

　　4 結(jié)論與展望

　　利用金納米顆粒進(jìn)行生物分子的檢測(cè)研究開展了十幾年，取得了突出的進(jìn)展和成果。由于金納米顆粒具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，其構(gòu)建的體系對(duì)生物分子的檢測(cè)，尤其是可視化檢測(cè)，可以減少傳統(tǒng)方法中對(duì)儀器的依賴，簡便快捷，靈敏度高，成本低廉。但將這類方法真正應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中，還需要做出更多的努力。首先需要解決金納米顆粒的穩(wěn)定性問題，包括金納米顆粒合成及形貌控制的穩(wěn)定性，分析檢測(cè)中結(jié)果的穩(wěn)定性及重復(fù)性，在進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)分析過程中的穩(wěn)定性問題等;其次，有些檢測(cè)方法的靈敏度仍然不能達(dá)到實(shí)際要求，需要傳統(tǒng)方法的輔助，存在進(jìn)一步優(yōu)化的空間;此外，將金納米顆粒體系用于實(shí)際樣品的檢測(cè)中，還需要保證檢測(cè)體系能夠在復(fù)雜樣品中依然表現(xiàn)優(yōu)異，使其具有更好的抗干擾能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的特異性檢測(cè)。對(duì)于金納米材料的穩(wěn)定性問題，膠體金試紙條的應(yīng)用給我們提供了一種解決思路。將液相存在的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相上，如引入層析試紙條或者試紙，可以提高其抵抗外界環(huán)境變化引起的穩(wěn)定性問題。對(duì)于檢測(cè)分析過程的穩(wěn)定性問題，可以考慮與微流控芯片等密閉操作結(jié)合，大大降低檢測(cè)過程中外部條件對(duì)其產(chǎn)生的干擾。在提高檢測(cè)靈敏度方面，引入一些放大反應(yīng)(如催化)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，也許是一種解決途徑。隨著納米科技的發(fā)展，金納米顆粒的可視化檢測(cè)體系必將會(huì)有更好的應(yīng)用前景。

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