克隆生物技術論文篇二

　　丹參SmNAC1基因的克隆和生物信息學分析

　　[摘要] 為了研究丹參中特有的NAC轉錄子在丹參生長發(fā)育、激素調節(jié)和抗逆脅迫應答調節(jié)中的功能，對丹參NAC轉錄因子進行了克隆和分析。根據丹參毛狀根cDNA文庫中篩選到的NAC EST序列，克隆了丹參SmNAC1的cDNA全長序列。生物信息學分析顯示基因的開放閱讀框591 bp，編碼166個氨基酸，相對分子質量21.66 kDa，等電點4.36 Genbank kF006346。SmNAC1蛋白的N-端具有保守的NAC_AB結構域，C-端高度變異。根據軟件預測SmNAC1可能定位在細胞核。qRT-PCR分析YE+Ag+處理后SmNAC1在丹參毛狀根中的表達變化，處理后2 h表達量上調至對照的1.5倍，4～12 h保持2倍的表達量，36 h時下降至對照水平以下，推測SmNAC1可能參與了丹參毛狀根對YE+Ag+的脅迫應答調節(jié)。

　　[關鍵詞] 丹參;NAC轉錄因子;SmBF3-2;分子克隆;生物信息學

　　NAC轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族，在植物的生長調節(jié)以及逆境應答分子網絡中扮演著極其重要的角色，目前為止已經從擬南芥中鑒定出117個NAC轉錄因子基因[1-2]，水稻中151個[3]，葡萄中143個[4]，毛果楊中163個[5]，煙草[6]和大豆[7]中各有152個。NAC家族轉錄因子N-端有一個高度保守的NAC結構域，可進一步分為A-E5個保守的子域，具有DNA結合(DNA Binding)或蛋白質和二聚體結合功能。與N-端的保守不同，NAC的C端無論是在氨基酸序列還是長度方面都具有高度的多樣性，具有轉錄激活、抑制或者與蛋白質結合活性[8]。實驗證明不同物種的高同源性NAC基因可能執(zhí)行不同的功能。NAC基因參與介導脅迫對植物生長發(fā)育的影響，這往往是生物脅迫間、非生物脅迫間以及生物與非生物脅迫間信號調控通路的關鍵節(jié)點[9]。目前關于NAC的研究較少，且多集中于擬南芥、水稻等模式植物。在丹參中僅克隆到1條NAC轉錄因子SmBTF[10]。本研究組從丹參毛狀根cDNA文庫中得到1條NAC轉錄因子的EST序列，在此基礎上克隆得到了SmNAC1基因的全長cDNA序列，并通過生物信息學分析其編碼的蛋白質理化性質、保守功能域等生物學信息，為進一步研究丹參中該類轉錄因子提供信息和依據。

　　1 材料

　　用丹參葉片經農桿菌ACCC10060介導產生的不定根[11-12]，用6，7-V培養(yǎng)基繼代， 恒溫26℃，80 r·min-1搖床暗培養(yǎng)培養(yǎng)18 d，用終濃度30 mmol·L-1Ag+和100 g·L-1酵母提取物聯(lián)合處理， 0，2，4，8，12，24 h取樣，液氮速凍，-80 ℃保存。

　　2 方法

　　2.1 RNA提取與反轉錄 采用Trizol法提取丹參毛狀根總RNA。取0.1 g毛狀根，加入0.2 mg聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVPP)，在液氮中研磨粉碎，加入1 mL Trizol(Ambion公司)室溫放置10 min充分裂解，4 ℃ 12 000 r·min-1離心取上清，依次用氯仿和異丙醇洗脫，75%乙醇-20 ℃沉淀2 h，最后用20 μL去除RNA酶的水溶解。用NANO Drop核酸定量儀測定RNA濃度，取1.0 μg RNA，應用Thermo反轉錄試劑盒，按照附帶的操作流程利用Oligo(dT)18引物反轉錄成總cDNA。

　　2.2 SmNAC1cDNA全長克隆 根據得到的SmNAC1基因片段設計PCR特異性引物SmNAC1-F：5′-ATGACTCAATCCCAGGAGGAG-3′，SmNAC1-R：5′-CTAGTTTGTGAGCTCCATAATGG-3′，以丹參毛狀根總cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系為ddH2O 15.4 μL，dNTP 1.6 μL，Ex Taq Buffer 2.0 μL，引物(10 nmol·L-1)各0.4 μL，Ex Taq(5 U·L-1)0.1 μL。擴增條件為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。用Thermo Gene JET PCR純化試劑盒純化PCR產物后連接pGEM-T easy載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取陽性單克隆送北京華大基因研究中心測序。

　　2.3 SmNAC1生物信息學分析 將全長cDNA序列在NCBI數(shù)據庫的 ORF Finder中分析SmNAC1序列的ORF，推導編碼氨基酸的基因序列。應用BLAST程序索相似蛋白，用Clustal W(對氨基酸序列進行多重比對，并用MEGA4 NJ法(bootstrap 1000)構建系統(tǒng)樹。在CCD數(shù)據庫)，InterProScan和ExPASy ScanProsite分析保守結構域，用Compute pI/Mw預測蛋白的理化性質。用TMHMM2.0進行跨膜域分析。SignalP 4.1 Server進行信號肽分析。WOLF PSORT和TargetP1.1Server分析蛋白的亞細胞定位。在CFSSP進行二級結構預測，Disulfind進行二硫鍵預測。在Swiss-Model進行蛋白的三級結構預測。
　　2.4 丹參毛狀根中SmNAC1表達譜分析 采用SYBR Green Premix染料(TaKaRa公司)進行qRT-PCR分析，以丹參β-actin作管家基因，分別以特異性引物SmNAC F：5′-CTCCCAACATCAGTCAAG-3′，SmNAC R：5′-ATGGCGGTGACGAT-3′，檢測SmNAC1在YE+Ag+處理丹參毛狀根0，2，4，8，12，24 h的表達變化。PCR體系為 SYBR Premix TaqTM 5 μL，正反引物各0.2 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，稀釋10倍的cDNA模板1.0 μL，加ddH2O至10 μL。PCR程序為，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s， 40個循環(huán)，增加溶解曲線。每個樣品設3個生物學重復。

　　3 結果

　　3.1 丹參SmNAC1基因序列分析 丹參SmNAC1基因全長591 bp，編碼196個氨基酸。Blastx檢索結果顯示，SmNAC1與野生馬鈴薯Solanum chacoense的NAC1，番茄S. lycopersicum NAC1-like，煙草Nicotiana benthamiana NAC1，水稻Oryza sativa Indica Group NAC-like，紫花苜蓿Medicago truncatula的相似度分別是84%，83%，84%，77%，73%。與SmBTF的相似度只有56%。SmNAC1蛋白55～120 位是NAC_AB(PS51151)的保守結構域。應用Softberry分析調控元件和PLANTCARE預測，C-端氨基酸有23個順勢作用元件，包括TGGTTT厭氧響應順式調控元件，AAACAGA赤霉素響應元件，GTTTTCTTAC參與脅迫防御應答的順式作用元件以及TCTTTAC光應答元件等。使用NetPhos 2.0 Server分析磷酸化位點，共發(fā)現(xiàn)10個磷酸化位點，其中絲氨酸位點7個，蘇氨酸位點2個，酪氨酸位點1個，沒有發(fā)現(xiàn)糖基化為點。

　　3.2 SmNAC1編碼蛋白質的基本性質分析 SmNAC1蛋白由196個氨基酸殘基組成，相對分子質量為21.66 kDa，等電點4.36。CFSSP 對SmNAC1蛋白進行二級結構預測，該蛋白包含87.8%的α螺旋結構， 36.7% 的β折疊結構和14.8%的無規(guī)卷曲，見圖1(由于α螺旋和β折疊交互計算，故幾種結構類型之和>100%)。無規(guī)則卷曲主要位于55～120個氨基酸功能區(qū)內，連接其他二級結構元件。在SWISS-MODEL用同源建模方法以人的NAC蛋白(3mcbA)為模板構建同源模型，對SmNAC1的NAC結構域氨基酸進行三級結構預測，結果見圖2。SignalP 4.0 Server和TMHMM 2.0分析顯示SmNAC1非氨基酸序列沒有信號肽，也不包含跨膜結構域，也不是分泌蛋白。亞細胞定位分析表明，該基因不定位于葉綠體或線粒體，推測可能定位在細胞核，具有DNA結合，激活，轉錄調控，乙?；裙δ?。

　　以人的NAC蛋白(3mcbA)為模板，E=9.311 57e-17。將SmNAC1與Genbank中17個物種25種蛋白進行比對，應用MEGA4使用NJ法(bootstrap 1000)構建系統(tǒng)進化樹。SmNAC1與茄科馬鈴薯S. chacoense NAC2(ScNAC2， ACB32231.1)，本氏煙N. benthamiana NAC(NbNAC，BAF46352.1)和番茄S.lycopersicum NAC(SINAC，XP_004249331.1)

　　親緣關系最近，見圖3。從圖中可以看出NAC的變異率是比較高的，同一植物的NAC蛋白并不聚在一起，如擬南芥中的擬南芥Arabidopsis thaliana中的5個蛋白NAC1-1(AtNAC1-1，NP_187845.1)，NAC1-2(AtNAC1-2，NP_190516.1)，NAC1-3(AtNAC1-3，NP_1196889.4)，NAC1-4(AtNAC1-4，NP_001078369.1)和NAC1-5(AtNAC1-5，AEE31552.1)，AtNAC1-1和AtNAC1-3聚為一小支，AtNAC1-4和AtNAC1-5聚為一小支，而AtNAC1-2則和蓖麻Ricinus communis NAC1-2(RcNAC1-2，XP_002521293.1)聚為一小支，三者間間隔距離較遠。玉米種的3個NAC蛋白中ZmNAC1-1(NP_001147422.1)和ZmNAC1-3(NP001148944.1)聚為一支，與ZmNAC1-2(NP_001147705.1)的距離較遠。水稻中的3個NAC蛋白則各自聚在不同的分支。可見NAC蛋白雖然具有保守的結構域，但是其結構的變異性非常大。

　　3.3 SmNAC1基因表達譜分析 對培養(yǎng)18 d的丹參毛狀根進行YE+Ag+處理，分析SmNAC1在處理后5個時間點的mRNA水平的相對表達量，見圖4。處理后2 h表達量上調至對照的1.4倍，處理后4 h表達量達到對照的2倍，8～12 h保持2倍的表達水平，處理后24 h SmNAC1下調至對照表達水平以下。說明SmNAC1響應YE+Ag+處理，參與了脅迫應答反應。

　　4 討論

　　NAC家族基因是陸生植物特異的轉錄因子家族，NAC蛋白參與植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成及多馬鈴薯Solanum chacoense NAC2(ScNAC2， ACB32231. 1);本氏煙Nicotiana benthamiana NAC(NbNAC，BAF46352. 1);番茄S. lycopersicum NAC(SINAC，XP_004249331. 1);丹參Salviae miltiorrhizae NAC1(SmNAC1，kF006346);黃瓜Cucumis sativus(CsNAC， XP_004171778. 1);葡萄Vitis vinifera NAC2(VvNAC2，XP_003632619. 1);野草莓Fragaria vesca subsp. vesca NAC(Fvssp. vescaNAC，XP_004306474. 1);擬南芥Arabidopsis thaliana NAC1-3(AtNAC1-3，NP_1196889. 4);擬南芥A. thaliana NAC1-1(AtNAC1-1，NP_187845. 1);水稻Oryza sativa Japonica Group NAC1(OsNAC1，BAB89723. 1);水稻O. sativa NAC1-3(OsNAC1-3，AAT01337. 1);葡萄V. vinifera NAC1(VvNAC1，XP_002283581. 2);二穗短柄草Brachypodium distachyon NAC(BdNAC，XP_003557882. 1);玉米Zea mays NAC1-3(ZmNAC1-3，NP001148944. 1);玉米Z. mays NAC1-1(ZmNAC1-1，NP_001147422. 1);大豆Glycine max NAC(GmNAC，XP_003554096);蒺藜狀苜蓿Medicago truncatula NAC1(MtNAC1，XP_003624883. 1);火炬松Pinus taeda NAC(PtNAC，AAF27917. 1);Micromonas sp. RCC299(Msp. NAC1，ACO64924. 1);Coccomyxa subellipsoidea C-169(CsuNAC1，EIE21909. 1);擬南芥A. thaliana NAC1-5(AtNAC1-5，AEE31552. 1);擬南芥A. thaliana NAC1-4(AtNAC1-4，NP_001078369. 1);水稻O. sativa NAC1-2(OsNAC1-2，AAM52321. 1);玉米Z. mays NAC1-2(ZmNAC1-2，NP_001147705. 1);擬南芥A. thaliana NAC1-2(AtNAC1-2，NP_190516. 1);蓖麻Ricinus communis NAC1-2(RcNAC1-2，XP_002521293. 1)。 　　種生物和非生物脅迫應答過程。如玉米的ZmSNAC1基因在低溫、干旱、高鹽及脫落酸處理后表達量顯著上調，而水楊酸處理后表達下調[13]。葡萄中的VvNAC1基因響應病原菌、脫落酸、茉莉酸和乙烯處理表達上調[14]。在巴西橡膠樹HbNAC1啟動子序列中有多個CCAAT-box，EECCRCAH1，MYB2CONAENSUSAT元件識別MYB和MYC轉錄因子，在ABA信號通路和非生物脅迫答應中起重要作用[15]。SmBTF3與SmNAC1氨基酸序列的相似度只有56%，但是在N-端都具有NAC-AB保守結構域，二級結構都以α螺旋為主。熒光定量PCR分析表明SmBTF3在根中的表達量最高，對ABA誘導的響應不明顯，干旱脅迫短時間內抑制其表達。本研究發(fā)現(xiàn)SmNAC1在YE+Ag+聯(lián)合處理后2 h表達量上調至對照的1.4倍，4 h上調至對照的2倍，24 h表達量下調至對照表達水平一下，可見丹參中的這2個轉錄因子在丹參的抗逆脅迫中起作用。

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