關于pcr技術論文(2)
關于pcr技術論文
副標題#關于pcr技術論文篇二
免疫―PCR技術研究進展
摘要：綜述了免疫-PCR的進展狀況，包括PCR的基本原理、PCR的改進、靈敏度、抗體/DNA marker連接物的制備、顯示系統(tǒng)、免疫PCR種類以及假陽性的控制等。
關鍵詞：免疫PCR 基本原理 靈敏度 PCR種類
中圖分類號：R446.6 文獻標識碼：B 文章編號：1004-7484(2011)18-0071-02
1992年Sano等人將免疫測定技術與聚合酶鏈反應(PCR)技術結合，創(chuàng)建了一種全新的極其敏感的抗原分子檢測技術，即免疫―PCR。該技術正是運用PCR的高度敏感性來放大抗原抗體反應的特異性，這種靈敏程度使免疫檢測技術達到了一個新的高度?，F(xiàn)在將免疫―PCR技術研究進展綜述如下：
1 免疫―PCR的基本原理
免疫―PCR主要由兩部分組成。第一部分是類似于普通酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的抗原抗體反應，第二部分是常規(guī)的PCR擴增和電泳檢測。免疫―PCR與ELISA的區(qū)別就在于ELlSA是以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶來標記抗體，用顏色反應來表明陽性或陰性結果，而免疫―PCR則是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標記抗體，用PCR擴增抗體所連接DNA，并進行電泳檢測，因此可由PCR產物的量來反映抗原分子的量。免疫―PCR的關鍵之處就在于用一個連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對應關系，從而將對蛋白質的檢測轉變?yōu)閷怂岬臋z測。
2 免疫-PCR的靈敏度
Sano T等應用免疫―PCR檢測包被在ELISA板上的牛血清白蛋白，比應用堿性磷酸酶染色的ELISA法，在檢測靈敏度上大約增加×105，由于PCR的巨大擴增能力和特異性，使得免疫―PCR技術靈敏度高于目前存在的任何抗原檢測系統(tǒng)，理論上可檢測單分子抗原。人甲狀腺刺激素(TSH)是評價甲狀腺功能的指標，血標本中正常濃度較低(5×10-12mmol/L，25×10-16mmol/L)，臨床一般用放射免疫測定超過了ELISA的檢測范圍。Hendrickson等用三明治夾心法免疫―PCR檢測TSH水平1fg(10-12mmol)。而用夾心法ELISA檢測水平[pg(10-16mol)前者靈敏度比后者高3個數量級。
3 免疫―PCR的改進
雖然Sano PP等人構建的免疫―PCR具有極高的靈敏度，但Sano所用的連接分子鏈親和素―蛋白A嵌合體還沒有商品化，因此限制了他在實際應用中的廣泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗體取代Sano免疫―PCR系統(tǒng)中的抗體，用商品化的親和素代替鏈親和素―蛋白A嵌合體作為連接分了構建了一個新的免疫―PCR系統(tǒng)。Ruzicka用此免疫―PCR系統(tǒng)檢測小鼠抗載脂蛋白E抗體，可以檢測出包被濃度為10fg/ml的E抗體。此外，Sano的免疫―PCR實驗流程需要眾多的洗滌步驟，使實驗過程相當繁瑣，并需要大量的操作時間。Zhou等人對此作了改進，他們用生物素化的二抗和游離鏈親和素作為連接分子進行免疫-PCR實驗，把每個步驟的洗滌次數從原先的7～15次減至3～5次，從而減少了操作時間，但不影響實驗結果的準確性。另外，用修飾過的抗原稀釋緩沖液代替Sano免疫―PCR中的TBS作為抗原稀釋液，它主要把TBS中胍的濃度調到2mmol/L，由此解決了抗原的溶解問題。Zhou檢測了人原癌基因ETS，檢測濃度可達9.6×1015mmol/L，是常規(guī)ELISA的10倍，與Sano的免疫―PCR系統(tǒng)相比，Ruzicka和Zhou所用的方法不需要特殊的試劑，生物素和親和素(鏈親和素)都已商品化，因此在實際操作中得到廣泛應用。
4 免疫―PCR的種類
多抗原分析物免疫―PCR，就是同時檢測多種抗原。放射性同位素、熒光索、酶和化學發(fā)光法標記的抗體，已被開發(fā)用于多分析物的檢測，但來自不同標記的重疊信號和掃描不同信號密度上的困難，使上述方法尚未試用，相對而言，DNA為多分析物區(qū)分提供了理想的分子標記。大小不同的DNA分子可以通過電泳準確、定量地區(qū)分。Hendrickson等用99個堿基的寡核甘酸標記的HCG抗體、85個堿基寡核苷酸標記的TsII抗體和55個堿基募核苷酸標記，β―Cal抗體同時檢測HCC、TSH 、β―Cal3個分析物，而PCR擴增時，3個寡核苷酸應用一對引物，但產物分子質量各為99bp、85bp、55bp，因而各個抗原得以鑒定，Zhou和Hendrickson分別談到單引物免疫―PCR，所謂單引物免疫―PCR，就是標記抗體的DNA指示分子的兩側翼含相同的引物序列，可用單引物PCR擴增。該法可提高PCR擴增效率，且適于多抗原免疫-PCR。雙相免疫―PCR，就是同時檢測病原體抗原又檢測病體基因的免疫―PCR，其原理就是一對用于擴增某病原體基因的引物，被人工加在標記抗體的DNA marker的兩端，使二者共用一對引物，但產物分子量大小不同，達到免疫―PCR在檢測抗原的同時，又檢測了目的基因?？傊?，目前而言，免疫―PCR可分為單分析物免疫―PCR、多分析物免疫-PCR、單引物免疫-PCR以及雙和免疫-PCR。
5 展望
免疫―PCR作為一種抗原檢測系統(tǒng)，同時具有抗原抗體反應的特異性和PCR的高靈敏度，適合于各種微量抗原的檢測，并可以直接檢測細胞上抗原。預先將抗體和標記DNA偶聯(lián)，簡化了實驗操作，并可同時檢測多種抗原。而標記物和引物被設計為帶有親和配體，則可用常規(guī)ETISA法檢測，隨著免疫―PCR技術的進一步發(fā)展完善，免疫―PCR的功能將得到更充分的發(fā)展，新的標記物和引物設計將擴展可檢測分析的范圍，簡化實驗的復雜性具有側鏈DNA標記物的偶聯(lián)物能夠承擔的標記物的檢測，產生更準確的結果，相信不久就會有商品化的免疫―PCR試劑盒問世。
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