rna干擾技術(shù)論文怎么寫(2)
rna干擾技術(shù)論文篇二
RNA干擾技術(shù)在消化系腫瘤基因治療中的應(yīng)用
【關(guān)鍵詞】 RNA干擾 小干涉RNA 消化系腫瘤 基因治療
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)所誘發(fā)，高度特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，使基因沉默的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，故又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post?transcriptional gene silencing，PTGS)[1]。RNAi是生物體在進(jìn)化過程中抵御病毒入侵，抑制由轉(zhuǎn)座子移動(dòng)或重復(fù)序列的積累引起的基因組不穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制，另外還是基因表達(dá)調(diào)控的一條重要途徑。小干涉RNA(small inter?fering RNA，siRNA)是指干涉RNAi過程中在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的長(zhǎng)約21～23核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子，是RNAi發(fā)揮功能的重要中間效能分子。RNAi自從1998年發(fā)現(xiàn)以來，就以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在功能基因組學(xué)研究中迅速占有一席之地，迄今已成為基因研究中不可或缺的工具之一，并且隨著對(duì)其作用機(jī)制的逐步了解和應(yīng)用技術(shù)的日漸成熟，已開始應(yīng)用于疾病防治等多個(gè)方面。本文就其機(jī)制，主要特征，以及在消化系腫瘤中的研究作一簡(jiǎn)單綜述。
1 作用機(jī)制及主要特征
1.1 作用機(jī)制
RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有兩種作用機(jī)制：一種是大于30 nt的長(zhǎng)雙鏈RNA(dsRNA)產(chǎn)生的廣泛的、非特異性效應(yīng)。其機(jī)制可能是激活了細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶R和RNA酶L，從而導(dǎo)致了非特異性的細(xì)胞凋亡。另一種是21～23 nt的短雙鏈RNA(siRNA)產(chǎn)生的相對(duì)具體的、特異性效應(yīng)。目前，RNAi在抗病毒及腫瘤中的研究主要集中在siRNA產(chǎn)生的特異性效應(yīng)，故下面主要介紹siRNA的作用機(jī)制。
siRNA的作用機(jī)制目前尚未完全闡明，但已基本達(dá)成共識(shí)，即①dsRNA在細(xì)胞內(nèi)與DICER酶(一種RNAaseIII家族中特異性識(shí)別dsRNA的酶)結(jié)合，隨即被分割成21～23個(gè)核苷酸的短鏈dsRNA，在這個(gè)過程中需要ATP的參與。②分割下來的短鏈dsRNA即為siRNA，它是RNAi的起始誘導(dǎo)物，與DICER酶形成RNA引導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，此時(shí)RISC無活性，隨后，siRNA經(jīng)歷一個(gè)依賴ATP的解雙鏈過程激活RISC[2]。③siRNA特異性地識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，并引導(dǎo)RISC結(jié)合mRNA，RISC中的DICER酶將mRNA切割成21～23個(gè)核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，導(dǎo)致不能進(jìn)行翻譯過程，從而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表達(dá)。④新產(chǎn)生的dsRNA(siRNA)可繼續(xù)形成RISC復(fù)合物進(jìn)入新一輪RNAi的循環(huán)，產(chǎn)生正反饋效應(yīng)。這一過程需在RNA依賴RNA聚合酶(RdRP)的條件下進(jìn)行。除上述機(jī)制外，轉(zhuǎn)基因真核生物dsRNA 還可引起相應(yīng)基因的甲基化，促使異常RNA產(chǎn)生，最終導(dǎo)致基因沉默[3,4]。
1.2 主要特征
1.2.1 高度特異性 RNAi嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則，只降解與之同源的基因的RNA，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。
1.2.2 高效性 相對(duì)很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，在哺乳動(dòng)物中雖沒發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效應(yīng)，但在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中只需摩爾級(jí)濃度的 siRNA 即可有效抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。
1.2.3 可傳遞性和可遺傳性 RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可跨越細(xì)胞的界限，甚至可以傳播至整個(gè)有機(jī)體及子代細(xì)胞。
1.2.4 濃度、時(shí)間雙重依賴性 在一定時(shí)間內(nèi)RNAi的效應(yīng)強(qiáng)度隨siRNA的濃度增高而增強(qiáng)，或濃度一定的情況下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，siRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生正反饋效應(yīng)，導(dǎo)致濃度增高，使RNAi效應(yīng)增強(qiáng)。
1.2.5 ATP依賴性 目前研究發(fā)現(xiàn)RNAi中至少有2個(gè)步驟消耗ATP[5]：DICER酶切割dsRNA成為siRNA并使其5′端磷酸化或胞內(nèi)磷酸化酶使導(dǎo)入的siRNA 5′端磷酸化而使其成為有活性的siRNA的過程;RISC活化即siRNA解雙鏈的過程。
2 RNAi在消化系腫瘤治療中的應(yīng)用
腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)等均有密切的關(guān)系。因此我們可以針對(duì)這些因素，利用RNAi相關(guān)技術(shù)在不影響正?；蚬δ艿臈l件下抑制突變基因表達(dá)或基因的表達(dá)過量，從而達(dá)到基因治療的目的。另外，腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，當(dāng)單一癌基因的阻斷不能完全抑制或逆轉(zhuǎn)時(shí)，可以設(shè)計(jì)一種針對(duì)同一家族多個(gè)基因的保守序列的siRNA分子，便可以同時(shí)抑制這一家族的多個(gè)基因表達(dá)，且抑制效果互不干擾。
2.1 原癌基因
原癌基因是細(xì)胞基因組內(nèi)正常的組成成分，自然狀態(tài)下無致癌作用，其主要作用是通過編碼生長(zhǎng)因子等調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化。原癌基因激活是腫瘤發(fā)生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成為目前研究腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。
2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人類腫瘤中呈活化狀態(tài)最普遍的原癌基因，有數(shù)據(jù)顯示此基因的突變現(xiàn)象存在于30%～50%的腫瘤組織中，在胰腺癌中可高達(dá)85%。Brummelkamp等[6]建立了突變體的表達(dá)系統(tǒng)即pSUPER?K?rasv12，轉(zhuǎn)染人胰腺癌CAPAN?1細(xì)胞系后，觀察到pSUPER?K?rasv12能顯著降低K?rasv12的mRNA表達(dá)水平。構(gòu)建突變體K?rasv12的siRNA病毒載體轉(zhuǎn)染CAPAN?1細(xì)胞亦能抑制細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，并阻止裸鼠腫瘤的形成;而對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好并產(chǎn)生克隆，體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)5周內(nèi)均長(zhǎng)出腫瘤，因此證明了該siRNA具有明顯的特異性和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。 同時(shí)，他們采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體RNA系統(tǒng)在體外也成功地抑制了ras基因的表達(dá)。
2.1.2 Fos基因 Fos基因是一個(gè)重要的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基因，其產(chǎn)物Fos蛋白與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。Fra?1蛋白是Fos蛋白家族的成員之一，主要在大腸癌Hct?116細(xì)胞株和BE細(xì)胞株中表達(dá)。用siRNA 轉(zhuǎn)染fosL基因，然后再轉(zhuǎn)染到BE細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Fra?1蛋白對(duì)細(xì)胞的增殖沒什么影響，卻極大地降低了BE細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，大約降低為原來的1/10[7]。
2.2 抑癌基因
由于抑癌基因在細(xì)胞增殖調(diào)控中起重要作用，因此也成為基因治療的重要目標(biāo)之一。p53基因是最早利用RNAi技術(shù)研究的基因之一，人體內(nèi)大約50%腫瘤的發(fā)生是p53基因突變的結(jié)果。p53基因能夠抑制DNA合成及誘導(dǎo)DNA修復(fù)來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，使細(xì)胞停滯在G1期。突變型p53失去對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控發(fā)生癌變。Martinez等[8]的報(bào)道中，將H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型p53和突變型p53的RNA表達(dá)型質(zhì)粒，結(jié)果，野生型siRNA明顯抑制野生型p53蛋白的表達(dá)，對(duì)突變型幾乎無效;而突變型siRNA顯著抑制突變型p53蛋白表達(dá)，野生型基因則不受影響。由此證明，RNA序列能特異性地分別抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)，并且對(duì)突變型p53的抑制可在一定程度上恢復(fù)野生型基因的表達(dá)和功能。這就為選擇性和個(gè)體化治療腫瘤提供了可能。
2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因
細(xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育有著舉足輕重的影響。凋亡過程的失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有研究表明[9]，將表達(dá)有綠色熒光蛋白(GFP)的Bcl?XLsiRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MGC?803，用RT?PCR和免疫熒光法檢測(cè)Bcl?XL的表達(dá)，48 h后發(fā)現(xiàn)，與siRNA陰性組相比，實(shí)驗(yàn)組GFP明顯減少，Bcl?XL蛋白和Bcl?XL mRNA表達(dá)減少到基準(zhǔn)水平以下，并有自發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，凋亡率達(dá)21.17%。這就說明Bcl?XL特異性siRNA能夠抑制凋亡抑制基因Bcl?XL的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MGC?803凋亡。
2.4 其他相關(guān)基因
2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等腫瘤的發(fā)病中起到重要作用，尤其見于彌散型胃癌。有研究表明將核仁蛋白NoL8特異性siRNA轉(zhuǎn)染3種彌漫型胃癌細(xì)胞ST?4，MKN45，TMK?1，可以有效地降低該基因的表達(dá)，并能誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，可以考慮把Her2作為胃癌基因治療的又一新的靶點(diǎn)[10]。
2.4.2 β?連環(huán)蛋白和APC基因 β?連環(huán)蛋白和APC基因是WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵成分。這些基因的突變可引起β?連環(huán)蛋白表達(dá)水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞過度增生，促進(jìn)結(jié)腸息肉和結(jié)腸癌的發(fā)生。Verma等[11]構(gòu)建了β?連環(huán)蛋白的多個(gè)靶區(qū)域，使得蛋白表達(dá)量降低90%。有學(xué)者進(jìn)一步用轉(zhuǎn)染β?連環(huán)蛋白siRNA 的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞注射裸鼠，發(fā)現(xiàn)有50%的老鼠存活超過70 d，而對(duì)照組則全部死亡。
2.4.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF) VEGF是體內(nèi)一種重要的促血管生成因子，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過程中均有著極其重要的作用。Zhang等[12]設(shè)計(jì)了針對(duì)鼠VEGF各亞型的siRNA，以DNA為模板在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)小片段雙鏈RNA的形成，干擾結(jié)果均特異性抑制相應(yīng)VEGF的表達(dá)。同時(shí)，Takei等[13]設(shè)計(jì)了針對(duì)人VEGF的siRNA，采用體外合成法得到相應(yīng)的siRNA，將其注入到荷瘤鼠模型的腫塊中。結(jié)果腫瘤組織中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明顯低于對(duì)照組，腫瘤體積亦明顯小于對(duì)照組。徐文華等[14]設(shè)計(jì)兩組針對(duì)VEGF?mRNA 的siRNA,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞系SGC?7901,觀察其細(xì)胞周期的變化。發(fā)現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞增多, S期細(xì)胞減少,細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期;并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生凋亡小體。這些結(jié)果無疑將給腫瘤的基因治療提供了新的思考方向。
2.4.4 TGF?β1 TGF?β1是一種多功能生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。它可使胃癌細(xì)胞表達(dá)的黏附分子如CD44表達(dá)增多;抑制腹腔內(nèi)淋巴細(xì)胞活性使其無法有效殺傷腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞以及血管生成，同時(shí)可使間皮細(xì)胞變形，腹膜纖維化等。吳濤等[15]利用載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)干擾TGF?β1，發(fā)現(xiàn)TGF?β1蛋白在人胃癌細(xì)胞株SGC?7901中下降約65.8%，腹膜間皮細(xì)胞TGF?β1蛋白下降約61.8%。這一結(jié)果有力證明了siRNA能抑制TFB?β1在人胃癌細(xì)胞株SGC?7901和腹膜間皮細(xì)胞中的表達(dá)，為今后胃癌腹膜轉(zhuǎn)移靶向治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
2.4.5 埃茲蛋白(Ezrin) Ezrin作為ERM (ezrin radixin moesin)蛋白家族的成員,是一種細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的連接蛋白，其主要功能是參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),接受胞外信號(hào),使骨架蛋白重新排布,并增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。近來發(fā)現(xiàn), Ezrin的表達(dá)與大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān),如Ezrin表達(dá)水平與黑素瘤的分級(jí)[16]和乳腺癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]均呈正相關(guān)。顏歌等[18]采用小干擾RNA 方法抑制腸癌細(xì)胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Ezrin mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力下降,穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這預(yù)示Ezrin蛋白有可能成為抑制腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。
2.4.6 多藥耐藥(multidrugresistance，MDR) MDR一直是腫瘤治療的棘手問題之一。研究證實(shí)抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相關(guān), Guo等[19]應(yīng)用siRNA敲除Runx3基因后發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物耐藥,將攜帶Runx3的真核生物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人類胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901,體外藥敏性分析顯示SGC?7901 對(duì)各種化療藥物敏感。進(jìn)一步分析顯示Runx3可以抑制MDR?1和MDR相關(guān)蛋白1 (MRP?1)啟動(dòng)子的活性, Runx3的高表達(dá)可能通過下調(diào)MDR?1，MRP?1，Bcl?2的表達(dá),進(jìn)而使胃癌細(xì)胞對(duì)化療敏感。另外，其中的MDR1基因的過度表達(dá)及其基因產(chǎn)物P糖蛋白增加是導(dǎo)致MDR的重要原因之一，Nieth等[20]設(shè)計(jì)了特異的siRNA分別處理胰腺癌EPG85?257RDB細(xì)胞和胃癌EPG85?181RDB細(xì)胞來抑制MDR1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞的MDR1的mRNA和蛋白表達(dá)量可降低90%以上，癌細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的耐藥作用分別降低了89%和58%。這也提示我們，siRNA介導(dǎo)RNAi技術(shù)為克服腫瘤耐藥問題可能提供新的策略。
2.4.7 保羅樣激酶1(Polo?like kinase 1, Plk1) Plk1是絲氨酸-蘇氨酸激酶之一，參與了有絲分裂的不同階段。Jang等[21]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)280例胃癌患者中Plk1表達(dá)率高達(dá)95%(268/280)，用RNAi的方法阻斷Plk1表達(dá)后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受抑。用siRNA敲除Plk1基因后，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B的表達(dá)增加，胃癌細(xì)胞堆積于G2/M期，有絲分裂紡錘體形態(tài)異常，染色體分離延遲，胞質(zhì)分裂延遲或者停止，增殖減慢[22,23]。另外，Plk1基因的缺失亦伴隨癌細(xì)胞凋亡的增加，提示Plk1可能成為胃癌基因治療的理想靶點(diǎn)。
3 問題與展望
RNAi這一方興未艾的新技術(shù)，為腫瘤及其他疾病的基因治療提供了新的途徑。但是仍有許多問題亟待解決：①如何在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶基因RNA轉(zhuǎn)移到所有腫瘤細(xì)胞并穩(wěn)定持久地抑制癌基因表達(dá);②如何確定21～23 nt左右的核甘酸序列作為siRNA模板的選擇原則;③如何提高載體系統(tǒng)的效率等等?？傊琑NAi技術(shù)作為一種研究的新工具，治療的新手段，隨著對(duì)其機(jī)制的不斷認(rèn)識(shí)和技術(shù)的改進(jìn)，必將在消化系腫瘤的研究及治療中擔(dān)任不可替代的角色，同時(shí)也預(yù)示著后基因組時(shí)代里一個(gè)嶄新的RNA時(shí)代的到來。
【參考文獻(xiàn)】
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