有些網友覺得pcr技術論文難寫，可能是因為沒有思路，所以小編為大家?guī)砹讼嚓P的例文，希望能幫到大家!

　　PCR技術的研究與現(xiàn)狀分析篇一

　　摘要：PCR技術是一種體外酶促合成、擴增特定DNA片段的方法。因其高強的特異性和靈敏度以及檢測速度快、準確性好等優(yōu)點，該技術已經廣泛地應用于水產、微生物檢測、臨床微生物、基因表達、腫瘤免疫、微小殘留病變的檢測，DNA拷貝數(shù)的測量、基因組變異和多態(tài)性等許多方面。本文主要介紹4種PCR技術及其在各個領域的應用現(xiàn)狀。 關鍵詞：PCR技術;分類;研究現(xiàn)狀;應用;

　　Research and Application Status of PCR Technology

　　Class 1 Bio-engineering 10 Student: Lao Yangyan Student ID: 1031250019 Tutor: Wei Dongmei Abstract: PCR is an in vitro enzymatic synthesis，amplification of specific DNA fragment. Because of its high-strength specificity and sensitivity，detection speed and good accuracy，it has been widely applied in many fields such as the aquatic，microbial detection，clinical

　　microbiology，gene expression，tumor immunology，detect ion of minimal residual lesion，measurement of DNA copy number，genome mutation，polymorphism and so on. This article summarize 4 kinds of PCR technology，with its application status is analysed.

　　Keywords: PCR technology;Category;Progress research;Application

　　引言

　　聚合酶鏈反應( PCR) 技術問世20多年以來, 已經在生物學研究領域內得到了巨大的發(fā)展并不斷的完善, 不僅廣泛應用在基礎研究領域, 在疾病診斷等方面也有了越來越廣泛深入的研究和應用。1985年，美國Karray等學者首創(chuàng)了PCR 技術，并且由美國Cetus 公司開發(fā)研制[1]。隨著科學技術的發(fā)展和突破，PCR 技術已在多個領域得到廣泛地應用，如微生物檢測、獸醫(yī)學、水產養(yǎng)殖等方面。由于該技術具有較強的靈敏度、準確度和特異性，又能快速進行檢測，因而其應用領域也在不斷延伸[2]。隨著PCR 技術的不斷發(fā)展，在常規(guī)PCR 技術的基礎上又衍生出了許多技術，如多重PCR技術、實時熒光定量PCR技術、單分子PCR 技術、變性梯度凝膠電泳技術。目前應用最多的為熒光定量。本文主要介紹4種PCR技術及其在各個領域的應用現(xiàn)狀。并對PCR的前景進行了展望，讓其更好的服務于人們的生活。 1 PCR技術原理

　　PCR 技術是根據待擴增的已知DNA片段序列、人工合成與該DNA 2條鏈末端互補的2段寡核苷酸引物，在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促作用下進行擴增。PCR 的整個技術過程經若干個循環(huán)組成，一個循環(huán)包括連續(xù)的3個步驟：第1步是高溫條件下的DNA模板變性，即模板DNA在93~94℃的條件下變性解鏈;第2步是退火，即人工合成的2個寡核苷酸引物與模板DNA鏈3’端經降溫至55℃退火;第3步是延伸，即在4種dNTP底物同時存在的情況下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物鏈將沿著5’-3’方向延伸與模板互補

　　的新鏈[3]。經過這個循環(huán)后，合成了新鏈，可將其作為DNA模板繼續(xù)反應，由此循環(huán)進行。循環(huán)進程中，擴增產物的量以指數(shù)方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次，DNA可擴增l00 ~200萬倍。PCR反應的步驟很簡單，但是具體的操作是復雜的，如退火溫度的確定、延伸時間的長短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應體系應該確定適當?shù)姆磻獥l件，以避免假陰性或假陽性等情況的產生。

　　2 PCR技術的分類

　　在傳統(tǒng)PCR 技術的基礎上，根據人們的需要以及各個領域的應用要求，又衍生出很多種類的PCR 技術。新技術在各領域廣泛應用并逐漸改進，為進一步的研究提供了基礎。

　　2.1 實時熒光定量PCR技術

　　1996 年，學者經過研究，在傳統(tǒng)PCR 技術的基礎上，首創(chuàng)了實時熒光定量PCR 技術，新技術已經應用至醫(yī)學領域、分子生物學和其他基礎研究領域。實時熒光定量PCR 技術基于傳統(tǒng)技術的優(yōu)勢，還具有實時性、準確性、無污染，實現(xiàn)了自動化操作和多重反應，是PCR 技術研究史上從定性到定量的飛躍[4]。熒光定量PCR 技術最大的特點是能將熒光基團加入到PCR 反應體系中，借助于熒光信號，累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[5]。實時監(jiān)測這一特點是常規(guī)PCR 技術所不具有的，因為其對擴增反應不能進行隨時的檢測。常規(guī)PCR 技術的擴增終產物需要在凝膠電泳等條件下才能進行，無法對起始模板進行準確的定量，而熒光定量PCR 技術的反應進程可以根據熒光信號的變化做出準確的判斷[6]。一個PCR 循環(huán)反應結束之后，定量PCR 儀可以收集1個熒光強度信號，熒光信號強度的變化可以反映產物量的變化情況，這樣就可以得到1條熒光擴增曲線[7]。熒光信號在指數(shù)擴增階段，PCR 產物熒光信號的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性對應關系，然后進行定量分析[8]。

　　2.2 多重PCR 技術

　　多重PCR(mutiplex PCR)技術是PCR 技術的一種，為同一管中加入多對特異性引物，與PCR 管內的多個模板反應，在一個PCR 管中同時檢測多個目標DNA分子。多重PCR技術可以擴增一個物種的一個片段，也可以同時擴增多個物種的不同片段[9]。在同一反應體系中，多重PCR 技術進行多個位點的特異性擴增時，引物間的配對、引物間的競爭性擴增等會對擴增效果產生重要影響。一方面，如果能選擇適宜的反應體系和反應條件，可極大地提高多重PCR 的擴增效果[10]。主要包括退火溫度、退火及延伸時間、PCR 緩沖液成分、dNTP 的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提質量也影響多重PCR 擴增效率，如DNA抽提不干凈或降解都將影響PCR 擴增效果[11]。

　　2.3 單分子PCR 技術(SM-PCR)

　　單分子PCR 技術是在傳統(tǒng)PCR 技術的基礎上發(fā)展的，基本循環(huán)過程相同，但在反應條件、模板數(shù)量、DNA聚合酶選擇、引物設計方面具有不同點。該技術是以少量或單個DNA分子為模板進行的PCR[12]。單分子PCR 技術反應中，DNA模板濃度極低，這就要求模板有較高的質量。因為這是試驗成敗的決定性因素。在設計引物時，應該嚴格控制GC 的含量和Tm值，同時盡量避免引物間存在可配對序列。在反應混合物模板數(shù)極低的情況下，若引物之間存在少量配對序列，擴增時極易形成二聚體，使反應無法進行，得不到所需要的產物[13]。由于單分子PCR 技術反應的變性溫度(96~98 ℃)大多比常規(guī)PCR 技術(94 ℃)略高，因而對DNA聚合酶熱穩(wěn)定性的要求也更加嚴格，需要有較好的熱穩(wěn)定性，以防止溫度過高而使其失活。其變性時間(5~15 s)、退火時間及延伸時間也短于常規(guī)PCR技術。

　　2.4 變性梯度凝膠電泳PCR技術(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

　　PCR-DGGE 技術是基于核酸序列的不同，將片段大小相同的DNA序列分開的一種技術方法[14]。在進行變性梯度凝膠電泳時，序列不同的DNA片段因為堿基組成和排列的差異，在聚丙烯酰胺凝膠中解鏈時需要不同的變性劑濃度，并會發(fā)生空間構型的變化，最終導致電泳遷移率的差異。將通過PCR擴增之后得到的等長雙鏈DNA分子，在含梯度變性劑( 如尿素、甲酰胺) 的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，電泳遷移率的差異會使不同序列的DNA片段停留在凝膠的不同位置，從而形成相互分開的條帶圖譜[15]。從理論上講, 只要選擇的電泳條件足夠精細, 就可以分開僅有1個堿基差異的DNA片段[ 16]。

　　3 PCR技術的應用

　　3.1 PCR技術在水產上的應用

　　基因表達是檢測某個基因在不同發(fā)育期或不同組織中的表達量變化，或受到某種試驗處理過程中的影響而出現(xiàn)表達量變化的情況。有學者應用real-time PCR 技術研究碳水化合物含量對翹嘴紅鲴糖代謝酶G6Pase、GK 以及PEPCK表達量的影響[17]，研究結果可為翹嘴紅鲴飼料配方中的最合適糖含量提供理論依據[18]。孫淑娜等研究葉酸拮抗劑對斑馬魚心臟發(fā)育相關基因BMP2b及HAS2表達的影響，表明葉酸拮抗劑對早期胚胎的心臟發(fā)育影響較大，可導致斑馬魚心臟發(fā)育延遲及心臟形態(tài)異常，并下調斑馬魚心臟發(fā)育相關基因BMP2b 及HAS2 的表達，這可能是葉酸生物學活性受抑后導致心臟發(fā)育異常的機制之一。Sawyer et al以斑馬魚的未受精卵、胚胎、仔魚和成魚為研究材料，采用實時熒光定量PCR 技術，檢測了P450aromA和P450aromB 在不同組織的表達量，表明在各組織中均有2種基因的表達，但表達量顯著不同，呈現(xiàn)組織特異性。

　　3.2 PCR技術在食品微生物檢測中的應用

　　實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術實現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍，除了具有常規(guī)PCR的快速、靈敏、操作方便等特點外，還具有以下優(yōu)點：全封閉反應，無需凝膠電泳等PCR后處理，減小對環(huán)境的污染;不使用有毒試劑，操作安全;定量準確;儀器在線實時監(jiān)測，結果直觀。

　　多重PCR技術是通過對普通PCR技術的改進而建立起來的一種技術，是將多條引物和多條模板混合在一個反應體系中分別特異擴增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應體系中擴增同一模板的不同片斷，常用于對超長片斷的擴增。與常規(guī)的PCR相比，還具有擴增效率高、產物特異性高和經濟簡便等特點，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測。

　　PCR-DGGE技術具有可檢測不可培養(yǎng)類細菌、檢測時間短、檢測率高、重復性好等優(yōu)點。近些年來，此技術在食品中檢測微生物后應用也有報道。

　　3.3 PCR技術在臨床微生物中的應用

　　許多傳染病的特點是具有高度的變異率，這會嚴重影響對致病菌的評估，分子信標可以用于病原菌的定量。它的優(yōu)點是: 一個沒有熒光的淬滅物可以用于4個不同的熒光染料， 這樣就可以同時檢測和定量4個樣本。在許多應用領域需要同時對多個核酸進行定量， 這將大大降低檢測的花費和所需的時間。這個方法的另一個好處在于加樣的誤差被最小化了， 而且所有核酸都是在相同的條件下同時擴增， 這樣它所獲得的數(shù)據就更加精確可靠。當然， 多通道檢測比單通道檢測更為復雜也需要解決可能出現(xiàn)的更多問題。廣東省花都市人民醫(yī)院、中山醫(yī)科大學基因診斷中心采用熒光定量PCR 檢測技術對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒等5個項目進行了定量測定， 結果表明定量PCR方法可靠性和重復性好，且操作簡便、快速，結果判斷客觀。除此以外，目前已有用此方法對人類免疫缺陷病毒，肝炎病毒，結核桿菌，巨細胞病毒，EB病毒，流感病毒A、B等病原體進行檢測的報道。

　　3.4 PCR技術在畜牧獸醫(yī)領域的應用

　　家育DNA多態(tài)性研究是近年來興起的分子水平遺傳標記選擇技術, 對于開展品種問遺傳差異程度、種群間親緣關系、個體問遺傳相似性, 親子鑒定等方面的工作, 對于開展數(shù)量性狀的間接選擇, 早期選擇, 提高數(shù)量性狀選擇效率等研究均具有重要的意義和潛在的應用價值。PCR技術的出現(xiàn)大大推動了上述研究的進程。以PCR技術為基礎的DNA多態(tài)性分析和檢測技術, 如PCR-RFLP(限制性長度多態(tài)性) , PCR-SSCP (多聚酶鏈反應產物的單鏈構象多態(tài)性) 和AFLP(擴增片斷長度多態(tài)性)等, 已經在豬DNA多態(tài)性研究中得到了應用, 并且有可能迅速推廣到育種實踐中去。

　　3.5 PCR技術在轉基因食品檢測中的應用

　　轉基因食品，是利用基因工程技術將有利的基因轉移到微生物,，植物或動物細胞內，使他們獲得有利的特性，再由這些轉基因物種生產或處理獲得的食品及添加劑。由此可增加食品的種類，提高產量，改進營養(yǎng)成分的構成，延長貨架期等，目前，轉基因作物及其產品的安全性問題越來越引起消費者的重視[25]。為了保護人類的健康，世界衛(wèi)生組織在20世紀90年代提出了對轉基因食品進行安全性評價的要求，對食品中的GMOs存在與否進行標示。因此，對食品中的GMOs 進行監(jiān)測，建立安全性檢驗的技術與方法，成為管理和審批工作的重要基礎。在眾多的監(jiān)測方法中，PCR 是最常用以及最適用的監(jiān)測轉基因食品的方法。PCR 方法中，常用的幾個特定序列分為三類：

　　1、調控序列：他們調節(jié)轉入植物的基因的表達。由于大多數(shù)轉基因食品的基因都含有CaMV 35S 啟動子和NOS 終止子，因此，在檢測食品中是否含有GMOs 時，可以直接檢測CaMV 35S 啟動子和/或NOS 終止子的存在與否，如果存在，即可說明其中存在GMOs。

　　2、標記序列，用于幫助在遺傳轉化中篩選和鑒定轉化的細胞，組織和再生植株，一般是抗生素抗性基因。

　　3、目的基因，即轉入的基因，如抗蟲、抗除草劑基因。用PCR 方法鑒定植株中檢出的目的基因，標記基因，報告基因，35S，NOS 等外源基因片段，為轉基因食品的篩選鑒定及為安全性評價提供敏感直接的數(shù)據，成為轉基因食品安全性檢驗中一項重要的技術手段。 4 PCR技術的應用前景展望

　　傳統(tǒng)PCR技術以及衍生出來的新型PCR技術自面世以來，已被廣泛應用到生命科學的各個領域。隨著技術方法的不斷改進與完善，熒光定量PCR技術將會逐漸完善并廣泛應用;多重PCR技術在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測中將具有重要作用。未來的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進樣品前處理技術等方面。

　　隨著研究的不斷深入發(fā)展與完善，許多相關的新類型及改良的PCR技術將會不斷涌現(xiàn)，這些派生出的新類型和新方法必將在未來食品檢測中有非常好的應用前景。

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　　pcr技術論文篇二

　　摘要：PCR技術又稱無細胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環(huán)進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點，是基因擴增技術的一次重大革新。PCR技術可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或對每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫(yī)學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發(fā)展。 關鍵詞：PCR原理、PCR過程及應用、關于PCR技術要點

　　1、PCR技術的基本原理

　　DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

　　PCR的過程類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復性)--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右維持一定時間，使含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個堿基對，過少則難保持與DNA單鏈的結合;②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以4種三磷酸脫氧核苷(dNTP)為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復制成雙鏈。重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”， 每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產物增加1倍，經反復循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴增。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　2、PCR技術的反應體系與反應條件

　　(一)標準的PCR反應體系：

　　10×擴增緩沖液 10ul

　　4種dNTP混合物 各200umol/L

　　引物 各10～100pmol

　　模板DNA 0.1～2ug

　　Taq DNA聚合酶 2.5u

　　2+ Mg 1.5mmol/L

　　加雙或三蒸水至 100ul

　　(二)PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg

　　(1)引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

　　設計引物應遵循以下原則：

　?、僖镩L度： 15-30bp，常用為20bp左右。

　?、谝飻U增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

　?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　?、鼙苊庖飪炔砍霈F(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

　　⑤引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

　?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子 克隆很有好處。

　　⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據庫的其它序列無明顯同源性。

　?、嘁锪浚?每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

　　(2)酶及其濃度。目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

　　(3)dNTP的質量與濃度。dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg結合，使游離的Mg濃度降低。

　　(4)模板(靶基因)核酸。模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，2+2+2+消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　(5)Mg濃度。Mg對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

　　(三)PCR反應條件的選擇：

　　PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。

　　溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

　　①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

　?、谕嘶?復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

　　復性溫度=Tm值-(5～10℃)

　　在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

　?、垩由鞙囟扰c時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子

　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子

　　高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

　　PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的3～4kb的靶序列需3～4min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 2+2+2+2+循環(huán)次數(shù)的設置：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

　　3、PCR反應的基本步驟

　　標準的PCR過程分為三步：

　　1。DNA變性(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

　　2。退火(復性)(25℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

　　3。延伸(68℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

　　每一循環(huán)經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

　　4、PCR技術的應用

　　PCR技術自1985年建立以來,發(fā)展之迅速,應用之廣泛,表明其具有強大的生命力。近些

　　年來,基于PCR的基本原理,許多學者充分發(fā)揮創(chuàng)造性思維,對PCR技術進行研究和改進,使PCR技術得到了進上步地完善,并在此基礎上派生出了許多新的用途。

　　反向PCR 反向PCR是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段,而常規(guī)PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段。實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切,然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接,再用一對反向的引物進行PCR,其擴增產物將含有兩引物外未知序列,從而對未知序進行分析研究。

　　不對稱PCR 不對稱PCR是用不等量的一對引物,PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(SSDNA)。這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物,其比例一般為50～100:1。在PCR反應的最初10～15個循環(huán)中,其擴增產物主要是雙鏈DNA,但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后,非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA。不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的絕對量,需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例。還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴增,制備雙鍵DNA,(dsDNA),然后以此dsDNA為模板,再以其中的一條引物進行第二次PCR,制備ssDNA。不對稱PCR制備的ssDNA,主要用于核酸序列測定。

　　參考文獻

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　　[3] 俞華,《PCR技術發(fā)展及應用前景》,人民日報,2003.12(5),第7版

　　[4] 馬中聲等,《分子生物學》,教育出版社,北京,2004