脆性X智力低下基因有什么研究
檢測脆性X染色體綜合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷貝數的多態(tài)性。下面小編為你整理脆性X智力低下基因FMR1中不穩(wěn)定DNA序列的研究，希望能幫到你。
【摘要】 目的 檢測脆性X染色體綜合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷貝數的多態(tài)性。 方法 采用PCR結合序列膠銀染法、Southern blot雜交分析法，對299條表型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(CGG)n拷貝數的多態(tài)性及分布頻率進行了測定和驗證。 結果 顯示其范圍為20～40，高峰為28，PCR-序列分析銀染法結果與Southern blot法結果完全一致。 結論 檢測了湖南省人群X染色體FRAXA位點(CGG)n拷貝數的多態(tài)性;運用PCR-序列分析膠銀染法快速、直接、簡便、實用，適合脆性X綜合征的大規(guī)模群體篩查。
【關鍵詞】 脆性X綜合征 FMR1 (CGG)n PCR
脆性X綜合征(fragile X syndrome，FraX)是常見的遺傳性智力低下性疾病之一，其發(fā)病率僅次于唐氏綜合征。在人群中男性的發(fā)病率約為1/4000 [1] ，女性的發(fā)病率為1/2500 [2] 。其在細胞學上主要表現為Xq27.3帶處有一細絲樣的脆性位點(FRAXA) [3] ，在分子水平上表現為FMR1基因5'端(CGG)n的異常擴增。(CGG)n在正常人群體中呈多態(tài)性，n=6-50，當n=50-200時為前突變，n>200時為全突變，同時伴隨其周圍CpG島異常甲基化 [4] 。我們根據FraX基因致病特點，通過測定湖南省人群中CGG重復序列，了解其分布的多態(tài)性，并建立一個簡便、快捷的基因檢測方法。
1 材料和方法
1.1 研究對象及標本 208名人群為本校附屬醫(yī)院門診自愿受檢者，男117名，女91名，年齡24～56歲，平均36.5歲。分別從肘靜脈抽取血1～2ml，以草酸鉀抗凝，標本按碘化鉀法提取DNA。
1.2 主要試劑 T 4 多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均為NEB公司產品，雜交液、尼龍膜、PCR擴增相關試劑均購自上海生工，探針PE5.1由美國紐約州立發(fā)育不全基礎研究所Nanbert Zhong博士惠贈。
1.3 PCR擴增 PCR引物設計參照文獻 [5] ，在FMR1基因內(CGG)n重復區(qū)域兩側合成引物。其中上游引物為:5'-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3'，下游引物為:5'-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3'。反應體積為20μl，其中包括10×PCR緩沖液，50～100ng模板，每種引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%為7-deaza-dGTP，10%DMSO，1UTaq DNA聚合酶。反應程序為:95℃預變性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
1.4 PCR產物的序列膠銀染法檢測 取10μl PCR產物加入載樣緩沖液于6%序列膠電泳。電泳畢經乙酸固定、Ag-NO3溶液染色及Na 2 CO 3 顯示后觀察結果。
1.5 Southern印跡雜交 取5μl PCR產物于6%序列膠電泳，常規(guī)電轉膜，用5′末端標記法以γ- 32 P-ATP標記探針PE5.1，經預雜交4h，雜交2h，充分洗膜后常規(guī)壓片，-70℃放射自顯影。
2 結果
2.1 湖南省人群中FRAXA位點(CGG)n的多態(tài)性及分布頻率用PCR方法分析了299條X染色體。經序列膠測定(圖2)，Southern印跡雜交法驗證(圖3)，表明(CGG)n的拷貝數在20～40之間(見表1)，頻率最高的為28(圖1)。
表1 湖南省人群中299條X染色體的CGG重復數 CGG重復數 等位基因數 構成比(略)
圖1 299條X染色體的(CGG) n 多態(tài)性分布圖 2.2 6%序列膠電泳檢測PCR產物 見圖2。
2.3 Southern blot檢測PCR產物 Southern印跡雜交結果顯示PCR擴增產物區(qū)帶所在位置與圖2完全一致(見圖3)。
3 討論
3.1 湖南省人群中FRAXA位點(CGG)n的多態(tài)性 299條M:PBR322/MSPI;1，2，3，4，5，6分別表示CGG重復數為28，28，31，28，28，29第1，6道為正常女性，第2，3，4，5道為正常 男性(下同)。
圖2 6%序列膠電泳
圖3 Southern印跡雜交
表型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(CGG)n測定結果顯示，其拷貝數范圍為20～40，高峰為28，占被檢總數的64.88%。Hofstee [6] 等報道的(CGG)n峰值為28，Jacobs [7] 等研究發(fā)現有2個高峰，即:19～23和28～31。本文結果與文獻報道基本相符，但未見到明顯的終端重復數，說明選取樣本有限。
3.2 PCR-序列分析膠銀染法的運用 目前已有多種篩查及診斷FraX的方法，但不同方法各有其局限性。如細胞遺傳學分析雖可以直接觀察染色體脆性位點的病變，但此方法檢出率較低;DNA連鎖分析較細胞遺傳學分析增加了可信度，但該技術需要有先證者，致使檢測受到一定程度的限制;經典的Southern blot法雖然準確性很高，但需要用同位素來標記，給操作者帶來了一定的危害，并且操作繁雜，費用昂貴，耗時長;常規(guī)的PCR法雖簡便，但因無法打開CG含量高的DNA模板導致擴增失敗。因此，探索出一個穩(wěn)定、快速、適合大規(guī)模人群篩查FraX的方法具有重要的意義。我們通過用7-deaza-dGTP代替dGTP的改良以降低Tm值，對299條X染色體的FRAXA位點(CGG)n進行了擴增，取得了較好的效果。檢測結果顯示湖南省人群的高峰為28，而且PCR序列膠銀染法與PCR-Southern blot法結果完全一致。因此。該方法對FRAXA的大量群體篩查具有重要的意義。
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